Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Этот протокол поможет исследователям более точно определить нативное олигомерное состояние мембранных белков за счет использования системы наночастиц нативной клеточной мембраны в сочетании с электронной микроскопией. Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает точные структурные данные мембранных белков в нативной клеточной мембраноподобной среде, и его можно использовать для будущего определения структуры с высоким разрешением. Демонстрировать процедуру будет Кайл Крёк, постдокторант из моей лаборатории.

Чтобы получить наночастицы нативной клеточной мембраны, ресуспендируйте один грамм интересующей мембранной гранулы в 10 миллилитрах NCMN Buffer A. Используйте стеклянный гомогенизатор Dounce для гомогенизации ресуспензионного образца клеточной мембраны при температуре 20 градусов Цельсия и перенесите взвешенный образец в полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте в образец исходный раствор мембранного активного полимера и дополнительный буфер NCMN A до конечной концентрации 2,5% мембранно-активного полимера и встряхните раствор в течение двух часов при температуре 20 градусов Цельсия. По окончании инкубации проводят ультрацентрифугирование пробы.

Во время центрифугирования уравновесьте пятимиллилитровую никелевую колонку NTA с 25 миллилитрами буфера NCMN A.At конце центрифугирования, перенесите надосадочную жидкость на колонку и с помощью шприцевого насоса, настроенного на скорость потока 0,5 миллилитра в минуту, загрузите надосадочную жидкость в колонку при температуре 20 градусов Цельсия. Промойте линии аппарата быстрой жидкостной хроматографии с достаточным количеством буфера NCMN B, чтобы полностью промыть систему и подключить колонку к хроматографу. Промойте колонку 30 миллилитрами NCMN Buffer B со скоростью потока один миллилитр в минуту и соберите проток.

Промойте колонку 30 миллилитрами NCMN Buffer C со скоростью потока один миллилитр в минуту и соберите проток. Разбавьте белок 20 миллилитрами NCMN Buffer D со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту и используйте коллектор фракций для сбора одного миллилитра образца, затем храните образцы белка при температуре четыре градуса Цельсия с помощью SDS-PAGE для проверки образцов, которые соответствуют пикам, наблюдаемым на графике элюирования быстрого белка жидкостной хроматографией. Чтобы приготовить сетки для отрицательных пятен, оберните предметное стекло фильтровальной бумагой угольной стороной вверх и поместите на предметное стекло сетки, которые будут использоваться для подготовки образца.

Поместите предметное стекло с сетками электронного микроскопа в камеру разрядника накаливания между двумя электродами и установите на место стеклянную крышку, убедившись, что крышка отцентрирована и хорошо закрыта. Запустите тлеющий аппарат и убедитесь, что фиолетовый свет, генерируемый плазмой, виден. Когда машина закончит работу, подождите, пока камера достигнет атмосферного давления, прежде чем снимать стеклянную крышку и ставить предметное стекло на стол.

Отрегулируйте концентрацию очищенных образцов белка примерно до 0,1 миллиграмма на миллилитр и загрузите 3,5 микролитра образца белка на углеродную сетку толщиной 10 нанометров. Через одну минуту с помощью листа фильтровальной бумаги удалите жидкость с поверхности сетки электронной микроскопии и промойте поверхность сетки три раза одной каплей воды объемом три микролитра за промывку. После последней промывки водой промойте поверхность сетки еще два раза тремя микролитрами свежего отфильтрованного 2% ацетата урана на одну промывку.

После последней промывки ацетатом урана окрасьте сетку трехлитровой каплей свежего отфильтрованного 2%-ного ацетата урана на одну минуту. В конце инкубации удалите каплю с помощью нового листа фильтровальной бумаги и высушите сетку на воздухе не менее одной минуты, прежде чем хранить решетку в сетчатом ящике для последующего использования. Здесь можно наблюдать негативные изображения окрашивания, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, как показано на рисунке.

Отрицательное окрашивание образца белка B канала резистентности к акрафлавину дикого типа, очищенного с помощью детергента, показывает однородный раствор монодисперсных частиц с белком, демонстрирующим четко выраженную тримерную четвертичную структуру. Эти тримерные структуры соответствуют наблюдаемой хроматограмме исключения размера после очистки. Для сравнения, на отрицательном изображении окрашивания мутанта P223G, также очищенного с помощью детергента, можно наблюдать гетерогенный раствор полидисперсных наночастиц со склонностью к агрегации, но без наблюдаемых нативных тримеров.

Эти результаты также подтверждаются эксклюзионной хроматографией. Аналогичные результаты наблюдались для белков дикого типа и мутантных белков после очистки мембранным активным полимером NCMNP11. Использование полимера NCMNP52 способствует получению наночастиц нативной клеточной мембраны в гораздо больших размерах, что позволяет визуализировать несколько тримеров белка B канала устойчивости к акрафлавину в одной частице нативной клеточной мембраны.

Однако в мутантном образце не наблюдается никаких тримерных частиц, даже при рассмотрении больших бислойных участков нативной клеточной мембраны. Анализ образцов очищенного белка с помощью SDS-PAGE подтверждает наличие резистентности к акрафлавину B во всех образцах с чистотой более 95% при прогнозируемой молекулярной массе белка. При модификации этого протокола для других белков важно экспериментально определить соответствующее количество мембранной фракции, а также продолжительность, время и температуру процесса солюбилизации.

Если изображения образца показывают однородный раствор монодисперсных частиц с четко определенными структурными единицами, образец можно использовать для определения структуры с высоким разрешением с помощью криоэлектронной микроскопии.