Измерение посттактного церебрального отека, зоны инфаркта и пробок гемо-мозгового барьера в одном наборе образцов мозга грызунов
October 23rd, 2020
Этот протокол описывает новый метод измерения трех наиболее важных параметров ишемической черепно-мозговой травмы на том же наборе образцов мозга грызунов. Использование только одного образца мозга является весьма выгодным с точки зрения этических и экономических издержек.
В настоящем протоколе мы представляем модифицированную технику окклюзии средней мозговой артерии, которая измеряет ишемическое повреждение головного мозга для определения зоны инфаркта, отека мозга и проницаемости ГЭБ в том же наборе мозга грызунов. С точки зрения этических и экономических затрат, основное преимущество этой методики заключается в том, что для всех трех измерений требуется только один образец мозга. Такая оценка основных параметров ишемического повреждения головного мозга поможет всесторонне исследовать патофизиологию ишемического инсульта.
Для начала удалите мозг крысы и отрежьте горизонтальные секции толщиной 2 миллиметра лезвием бритвы из нержавеющей стали толщиной 0,009 дюйма без покрытия. Поместите срезы с температурой 0,005% TTC и инкубируйте их в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, затем поместите мозговую ткань на предметные стекла микроскопа и выполните оптическое сканирование шести срезов мозга с разрешением 1600 x 1600 DPI. Используйте фоторедактор, чтобы добавить синий фильтр к изображениям.
Открыв программу, перейдите в раздел «Изображение», «Настройки» и «Микшер каналов». Выберите синий цвет в качестве выходного канала и отметьте монохромный, затем нажмите OK. Сохраните изображение в формате файла JPEG.
Используйте инструмент выделения многоугольников в ImageJ версии 1.37, чтобы выделить каждое полушарие каждого из шести срезов мозга и сохранить его как отдельный файл изображения. Чтобы рассчитать объем инфаркта и отек мозга, используйте макрос для преобразования пикселей на изображении в белый или черный цвет в зависимости от порогового значения. Затем закройте все файлы и с помощью второго макроса сравните количество белых и черных пикселей, чтобы определить объем инфаркта и отек мозга.
Скопируйте необработанные данные в таблицу. При расчете объема инфаркта корректируйте отек тканей с помощью соотношений ипсилатерального и контралатерального полушарий головного мозга. Выражают участки отека мозга в процентах от стандартных площадей непораженного контралатерального полушария.
Определите нарушение гематоэнцефалического барьера через 24 часа после окклюзии. Разделите правое и левое полушария на шесть ломтиков и положите каждый ломтик в микроцентрифужную пробирку. Гомогенизируйте каждый срез мозговой ткани трихлоруксусной кислотой, используя 4 миллилитра 50% трихлоруксусной кислоты на грамм мозговой ткани.
Центрифугируйте образцы при температуре 10 000 раз G в течение 20 минут, затем переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и разбавьте ее в соотношении 1:3 с 96% этанолом. Выполните люминесцентную спектрофотометрию с помощью планшетного ридера. Независимый выборочный t-критерий показал, что 19 крыс, перенесших постоянную окклюзию средней мозговой артерии (MCAO), продемонстрировали значительное увеличение объема инфаркта головного мозга по сравнению с 16 крысами, которые были прооперированы.
Крысы, которым была проведена постоянная MCAO, также продемонстрировали значительное увеличение степени отека мозга и разрушения гематоэнцефалического барьера через 24 часа, по сравнению с фиктивными животными. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что концентрация химических веществ соответствует протоколу. Этот протокол дает возможность оценить все три параметра ишемического повреждения в одном образце мозга.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает модифицированную технику окклюзии средней мозговой артерии для оценки ишемического поражения мозга путем оценки зон инфаркта, отека мозга и проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в одних и тех же образцах мозга грызунов. Использование одного образца мозга повышает этическую и экономическую эффективность, позволяя проводить комплексное исследование патофизиологии ишемического инсульта.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Ишемическое поражение мозга
- Модели грызунов
Фон
- Ишемический инсульт является значимой причиной заболеваемости и смертности.
- Оценка множества параметров поражения мозга может улучшить понимание механизмов инсульта.
- Текущие методы часто требуют нескольких образцов, создавая этические и ресурсные ограничения.
- Это исследование представляет упрощенный подход к измерению различных показателей повреждений с использованием одного образца.
Цель исследования
- Разработать метод измерения объема инфаркта, отека и нарушения ГЭБ в мозге грызунов.
- Улучшить эффективность использования ресурсов и снизить зависимость от множества образцов животных.
- Способствовать более полному пониманию ишемического поражения мозга и восстановления.
Используемые методы
- Метод включает использование образцов мозга крыс после индукции ишемического поражения окклюзией средней мозговой артерии.
- Секции мозга готовятся и анализируются на наличие различных параметров повреждений, включая отек и целостность ГЭБ.
- Ключевые шаги включают обработку изображений, пиксельный анализ для расчета объема инфаркта и спектрофотометрию для оценки нарушения ГЭБ.
- Данные количественно оцениваются и сравниваются между ишемическими и контрольными группами с использованием статистического анализа.
Основные результаты
- Протокол позволяет одновременно измерять объем инфаркта, отек и целостность ГЭБ в моделях крыс.
- Значительное увеличение этих параметров наблюдалось у крыс с вызванной ишемией по сравнению с контрольными группами.
- Результаты подчеркивают эффективность этого метода в оценке ишемического повреждения при снижении использования животных.
Выводы
- Это исследование демонстрирует новый метод одновременной оценки ключевых параметров ишемического поражения мозга.
- Подход улучшает понимание патологии инсульта и способствует более этичным методам исследования.
- Последствия распространяются на потенциальные терапевтические разработки и понимание нейропротекторных стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Measuring multiple ischemic injury parameters in a single rodent brain sample reduces animal use and experimental variability, supporting ethical and cost-efficient preclinical stroke research. This integrated assessment enables more reliable target validation and mechanistic de-risking in neuroprotective drug discovery. The method enhances predictive confidence by correlating infarct volume, edema, and BBB permeability within the same biological system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking infarct zone, edema, and BBB breakdown in a unified pathophysiological readout.
- Operational Value: Reduces sample size requirements, improving throughput and consistency in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, quantitative outputs for infarct volume and edema via pixel-based image analysis, supporting assay reproducibility.
- Operational Value: Uses accessible tools like ImageJ macros and spectrophotometry, facilitating technology transfer across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling key stroke pathophysiology endpoints in a single sample.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of biomarker continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering multiparametric readouts that inform go/no-go decisions in stroke therapeutics.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling concurrent measurement of structural and functional injury markers.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative data on infarct and edema through standardized image processing and normalization.
- Analytics: Generates comparable datasets via luminescence spectrophotometry for BBB integrity and corrected infarct volume calculations.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical continuity by validating edema and BBB disruption as translatable injury biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neuroprotective compounds across multiple injury dimensions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing biological noise from inter-animal variability in multiparametric stroke assessment.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined sectioning, staining, and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing animal consumption and enabling higher-information-content experiments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stroke therapeutics based on concordant infarct, edema, and BBB data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, image analysis (ImageJ), and spectrophotometry for accurate parameter quantification.
- Depends on precision instrumentation including microtomes, plate readers, and calibrated imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of staining thresholds, macro parameters, and data normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different rodent strains or injury models.
- Practical limitations include dependency on consistent tissue sectioning and chemical reagent purity for reliable BBB measurements.
