Моделирование первичных опухолей костей и метастазов в кости с имплантацией солидного опухолевого трансплантата в кость

Это исследование обеспечивает гибкость при создании первичных опухолей костей или метастазов в кости путем размещения солидных опухолевых трансплантатов в кости. Эта методика является отходом от введения суспензий опухолевых клеток в кость. Этот метод преодолевает ограничение инъекций суспензии опухолевых клеток в легкие эмболов.

Еще одним преимуществом является создание более однородной модели по сравнению со спонтанным метастазированием в кости или после внутрисосудистого введения клеток. На основе имплантации трансплантата солидной опухоли существуют возможности, выходящие за рамки человеческих или мышиных моделей, но использование ксенотрансплантатов, полученных от пациента, может привести к терапии, адаптированной к конкретным пациентам. Основное внимание уделяется исследованиям рака, таким как микроокружение опухоли, метастазирование, разработка лекарств, генетика рака и прецизионная медицина.

Визуальная демонстрация является ключом к демонстрации ключевых этапов создания подкожной опухоли, рассечения и создания опухолевого трансплантата, а также хирургической имплантации в большеберцовую кость. Для подкожной индукции опухоли собирают интересующую клеточную линию с использованием соответствующего раствора для диссоциации клеток и ресуспендируют клетки в соотношении один-два раза от 10 до пятой клетки до 100-150 микролитров стерильной концентрации PBS. Поместите клетки на лед.

Очистите открытые участки кожи 70% этанолом и загрузите клетки в туберкулиновый шприц, оснащенный иглой 27 калибра. Затем введите клетку подкожно в область продезинфицированной кожи, которая не будет затронута движением лопаток. Используйте штангенциркуль для контроля размера подкожной опухоли, покрывающей дорсальную грудную клетку или брюшную полость, и измеряйте массу тела животного еженедельно, чтобы убедиться, что опухоль не изъязвлена или что мышь не соответствует критериям раннего удаления, установленным Комитетом по уходу за животными и их использованию.

Когда опухоль достигает 15 миллиметров в любом размере, используйте 70% этанол для стерилизации кожи и используйте 15 скальпеля для разреза кожи, лежащей над опухолью. С помощью стерильных хирургических ножниц резко рассеките опухоль из окружающих прикрепленных мягких тканей и поместите опухоль в одну лунку шестилуночного планшета, содержащего полную питательную среду. С помощью скальпеля измельчите опухоль на фрагменты соответствующего размера и поместите фрагменты в новую емкость со стерильной питательной средой при комнатной температуре.

Для криоконсервации объедините несколько фрагментов в одном криовиале в полную питательную среду с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида и используйте коммерческую систему криоконсервации при температуре минус 80 градусов Цельсия для постепенной заморозки ткани перед долгосрочным хранением в жидком азоте. Чтобы сохранить фрагменты опухоли для последующего анализа, но не для будущей имплантации, заморозьте образцы методом погружения в жидкий азот и храните замороженные фрагменты опухоли в течение длительного времени при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для подкожной имплантации фрагментов опухоли сначала доведите суспензию опухолевых фрагментов до комнатной температуры.

Затем подтвердите отсутствие реакции на педальный рефлекс у мыши-реципиента, находящейся под наркозом, и подкожно введите анальгезию. Чтобы свести к минимуму потенциальную травму кожи, используйте крем для депиляции для удаления волос на правом коленном суставе и проксимальном отделе большеберцовой кости подключенной задней конечности. Очистите открытые участки кожи 70% этанолом, а затем чередуйте скрабы с хлоргексидином и солевым раствором.

При сгибании и разгибании сустава визуализируйте проксимальный отдел большеберцовой кости как область, расположенную дистальнее коленного сустава, и используйте лезвие 15 скальпеля для создания трех-четырехмиллиметрового разреза на уровне проксимального отдела большеберцовой кости на медиальной поверхности конечности через кожу и подкожную клетчатку, чтобы обнажить медиальную кору проксимального отдела большеберцовой кости. Чтобы создать небольшое отверстие в медиальной коре проксимального отдела большеберцовой кости, используйте кончик иглы 25 калибра, чтобы слегка надавить, вращая кончик примерно на два миллиметра дистальнее коленного сустава и на равном расстоянии между черепной и каудальной корой большеберцовой кости. Когда отверстие будет создано, используйте стерильные щипцы или иглу 27-30 калибра, чтобы ввести минимум 0,5 кубических миллиметровых фрагментов опухоли в медуллярную полость проксимального отдела большеберцовой кости, и используйте иглу 27-30 калибра для манипулирования фрагментами опухоли в медуллярном канале.

Поместив все фрагменты, противопоставьте края кожи соответствующим материалом и верните животное в клетку с наблюдением до амбулаторного состояния. Затем оцените рост опухоли большеберцовой кости неинвазивным способом с помощью еженедельной цифровой рентгенографии, биолюминесценции или флуоресцентной визуализации и используйте штангенциркуль для измерения конечности в месте имплантации. Успешное приживление может быть задокументировано с помощью передовой визуализации.

В этом репрезентативном анализе кортикальный дефект, созданный для имплантации опухолевого трансплантата, был виден в проксимальном отделе большеберцовой кости через неделю после имплантации. Ко второй неделе можно было наблюдать видимый остеолиз и ремоделирование кости рядом с кортикальным дефектом. Со второй по пятую недели происходило дополнительное прогрессирующее разрушение кости и образование новой кости, связанное с приживлением и ростом опухоли.

Следует соблюдать осторожность при создании небольшого отверстия в проксимальном отделе большеберцовой кости. Полагайтесь на вращение наконечника с мягким или минимальным давлением, позволяющим кончику иглы выполнять свою работу. После этой процедуры может быть выполнено размещение опухолевого трансплантата в других участках кости, размещение органоидов или опухолевых клеток во внеклеточном матриксе в костном дефекте или молекулярный и гистологический анализ в дополнение к визуализации.