Количественная оценка приема макроэлементов в термогенетического нейронального экрана с использованием drosophila Larvae

Наш протокол позволяет идентифицировать популяции личиночных нейронов, кодирующих выбор питательных веществ, связанных с контролем уровня потребления двух основных макронутриентов, белков и углеводов. Простота и относительно высокая производительность нашего метода позволяют количественно оценить потребление пищи для нескольких генотипов, подвергшихся воздействию различных условий питания. Чтобы генетически пересечь родительские линии, установите 60-миллиметровые клетки для сбора эмбрионов с диетическими пластинами L3, дополненными активным дрожжевым пастой.

Переведите взрослых девственниц TripA1 и самцов Janelia GAL4 в возрасте от пяти до восьми дней в клетки для сбора эмбрионов и дайте возможность спариванию происходить в течение 24-48 часов при температуре 25 градусов Цельсия при влажности 60% и темном цикле 12, 12. После брачного периода пересадите спаренных взрослых мух в свежие диетические пластины L3 и дайте отложить яйца в течение трех-четырех часов при температуре 25 градусов Цельсия. Убедитесь, что на всех пластинах есть маркировка с указанием генотипа и даты закладки яиц.

Когда период яйцекладки закончится, уберите пластины из клеток и оцените количество яиц на тарелке, подсчитав количество эмбрионов в одной четверти тарелки. Поддерживайте плотность личинок не более чем до 200 эмбрионов на пластине и накрывайте пластины пластиковыми крышками. Инкубируйте пластины для выращивания L3 при температуре 18 градусов Цельсия, влажности 60% и цикле 12-12 светлых темнок в течение девяти дней.

После инкубации соберите три группы по 10 L3 от каждого из тестируемых генотипов, а также одну группу из 10 L3 для контроля пищевых продуктов без красителей. Используйте щипцы номер пять или легкие щипцы, выполняя сбор личинок максимально бережно. Переложите собранных личинок в пластиковую тарелку весом лодочек, содержащую один миллилитр воды.

30 градусов Цельсия и поддерживайте высокий уровень влажности, добавив в него лоток, наполненный водой, чтобы избежать обезвоживания личинок во время анализа. Уравновесьте температуру пробирных пластин, нагрев их до 30 градусов Цельсия перед началом работы. Убедитесь, что на всех пластинах указан генотип и соотношение белков и углеводов рациона.

Испытайте тепловой шок у подопытных личинок в течение двух минут, непосредственно перенеся пластиковые лодки с животными в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Установите необходимое количество таймеров на один час, затем аккуратно слейте воду с пластиковых лодок и перенесите группы L3 с лодок в центр тарелок активов. Накройте пластины крышками и запустите таймер.

Дайте личинкам покормиться в течение одного часа при температуре 30 градусов Цельсия в темное время суток. Прекратите пробирное кормление, переложив пластины в ледяную ванну. Приготовьте две миллилитровые микропробирки для каждой тестируемой L3-группы, содержащие достаточное количество 0,5-миллиметровых стеклянных шариков для заполнения нижней части микропробирки и 300 микролитров ледяного метанола.

Используйте настольный охладитель, чтобы микротрубки оставались холодными. Осторожно извлеките группы L3 из подающих пробирных пластин и переложите их на крышки планшетов с небольшим количеством воды. Промойте личинок, чтобы удалить остатки пищи с их тела, стараясь не получить травм.

Перенесите личинок в подготовленные микропробирки и лизируйте их тканевым лизером, чтобы извлечь пищевой краситель из кишок. Перенесите экстракты в чистые микропробирки объемом 1,5 миллилитра, непосредственно перевернув две микропробирки на новые пробирки. Делайте это аккуратно, чтобы большая часть стеклянных шариков оставалась на дне двухмиллилитровой трубки.

Очистите клеточный мусор путем центрифугирования экстрактов с максимальной скоростью и четырьмя градусами Цельсия в течение 10 минут, затем перенесите надосадочную жидкость в чистые пробирки объемом 1,5 миллилитра. Для выполнения калориметрического количественного определения потребления пищи готовят стандартные растворы синего красителя путем последовательного разбавления его один к двум в метаноле. Перенесите 100 микролитров экспериментальных образцов, стандартов и заготовки в лунки 96-луночного микропланшета и измерьте поглощение на 600 нанометрах.

Этот протокол был использован для количественной оценки относительных количеств макронутриентов, потребляемых животными в условиях термогенетической активации конкретных нейронных популяций в нервной системе личинок. Активация отдельных популяций нейронов существенно влияла на баланс макронутриентов у личинок третьего возраста. Наблюдаемый характер кормления для контрольной линии, обозначенный здесь серым цветом, показывает ожидаемое снижение потребления пищи в рационах с более высоким соотношением белка и углеводов, демонстрируя эффективность метода.

Пять фенотипических классов, которые были установлены для экспериментальных животных: много есть и компенсировать разбавление белка перееданием, есть много, но не компенсировать, есть мало, но компенсировать, есть мало и не компенсировать, питаться аберрантно. Для каждого из этих фенотипических классов и генотипов показаны паттерны GFP в центральной нервной системе личинок третьего возраста. При использовании этого протокола важно создать синхронизированные с развитием личинки раннего третьего возраста, чтобы свести к минимуму вариации, связанные с поведением животных.

Следуя этому протоколу, радиомаркировка продуктов питания позволит подтвердить и в дальнейшем проанализировать попадания, обнаруженные с помощью этого метода.