Автоматизированная мультиплексирование образцов с помощью комбинированной изотопной маркировки прекурсоров и исобарической маркировки (cPILOT)

Наш автоматизированный протокол cPILOT упрощает для исследователей анализ образцов с высокой пропускной способностью. Это важно, потому что позволяет нам получить биологическую информацию о заболеваниях или различных условиях намного быстрее. Основным преимуществом этого метода является то, что он помогает обрабатывать несколько образцов параллельно, тем самым уменьшая действия ошибок при использовании высокой пропускной способности образцов.

Наша лаборатория заинтересована в приложениях, связанных со старением и болезнью Альцгеймера. Тем не менее, этот метод также может быть использован для изучения любого заболевания или вызов, где Есть биологические ткани участие. Начните с включением аппарата положительного давления, нагревательного и охлаждающего устройства, а также вакуумных насосов.

Соедините все аксессуары с жидким обработчиком, который покажет синий свет, как только он подключен к компьютеру и готов к работе. Aliquot 300 микролитров однородной печени в 500 микролитровую трубку и поместите его на две миллилитровые глубокие пластины хорошо. Храните образец при четырех градусах Цельсия до начала протокола.

Откройте метод в программном обеспечении и поместите необходимые советы и лабораторные программы в свои позиции. Затем перепроверьте окончательный макет колоды и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол. Загрузите 230 микролитровых наконечников и аспиратор 90 микролитров восьми молярных мочевины из резервуара.

Затем обойтись его грести один из черных двух миллилитров глубокой пластины хорошо. Разгрузите кончики TL1 и повторите этот шаг до тех пор, пока мочевина не будет добавлена во все скважины. После добавления буфера денатурации, используйте 90 советов микролитров для передачи 10 микролитров гомогената печени мыши в глубокую пластину хорошо.

Разгрузите наконечники, затем загрузите один ряд из 90 микролитров и аспирировать три микролитров DTT из реагентной пластины один. Обойти DTT для строк один и два из глубокой пластины хорошо. Печать образца пластины с алюминиевой фольгой и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 600 секунд при повороте при 300 об/мин.

После инкубации загрузите один ряд из 90 наконечников микролитров, аспирировать шесть микролитров IAM из реагентной пластины один на третий ряд, и раздать его грести один из образца пластины. Печать образца пластины и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут при повороте при 300 об/мин на охлаждающем устройстве. Затем распечатать образец пластины и загрузить один ряд из 90 микролитров советы.

Аспират пять микролитров цистина из реагентной пластины один на ряд два и обойтись его в ряды один и два образца пластины. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации выполните приуми время встряхивания 1800 об/мин в течение 30 минут.

Затем добавьте 800 микролитров 20 миллимолярный буфер Tris с 10 миллимолярный хлорид кальция в каждую хорошо на образца пластины, чтобы разбавить концентрацию мочевины до двух моляров. Добавьте 20 микролитров трипсина в первый ряд пластины из 96 колодцев и поместите пластину в указанное место на палубе. После добавления трипсина в образец пластины, запечатать его и инкубировать его в течение 15 часов при 37 градусов по Цельсию и 600 об /мин на нагревательное и охлаждающее устройство.

Остановите пищеварение, аспирируя 150 микролитров 5%-кремовой кислоты из строки три из пластины formic кислоты и распределяя его в образец пластины на ряды один и два. Приступайте к опреснетию пептидов. Используйте 1070 микролитров советы аспирировать 600 микролитров ацетонитрила.

Затем раздай его рядами один и два из твердой фазы извлечения, или SPE пластины, чтобы активировать C-18. Затем загрузите переваренный образец на пластину SPE в два прохода. Загрузите два ряда наконечников, аспиратор 534 микролитров переваренных образцов, и раздайте их в ряды один и два из пластины SPE.

Нанесите давление на пластину и повторите этот шаг до тех пор, пока все образцы не будут загружены. Очистите пептиды, промыв воду и разбавьте пептиды от 60 до 40 ацетонитриле в 0,1% кремной кислоты. Затем поместите пластину поверх пластины коллекции, чтобы утаить пептиды с помощью аппарата положительного давления.

Нарисуйте поток через и настроить необходимые советы и labware в программном обеспечении, перепроверить с макетом палубы, и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол для диметиляции. Восстановить пептиды в 1%acetic кислоты. Для выполнения маркировки диметилирования загрузите 90 наконечников микролитров и оспиратив 16 микролитров 60 миллимолярный световой формальдегид из второго ряда реагентной пластины.

Выгрузите его, чтобы грести один из образца пластины, а затем выгрузить советы. Загрузите один ряд из 90 микролитровых наконечников и аспират 16 микролитров 60 миллимолярный тяжелый формальдегид из ряда три реагентной пластины два. Выгрузите его строку два образца пластины и выгрузить советы.

Загрузите два ряда из 90 микролитров наконечников и аспират 16 микролитров 24 миллимолярный цианоборогидрид натрия и 24 миллимолярный цыанобородегид из рядов один и два реагентов пластины три, а затем обойтись реагентов строк один и два образца пластины, чтобы начать реакцию диметиляции. Разгрузите кончики и используйте орбитальный шейкер для выполнения приурочных встряхивания в течение 15 минут при 1800 об/мин. Затем загрузите два ряда из 90 микролитров и аспирировать 32 микролитера по 1%аммиака из рядов три и четыре реагентной пластины три.

Раздай его в ряды один и два образца пластины два, чтобы остановить реакцию. Объедините равные объемы легких и тяжелых диметилированных пептидов в новой двухми миллилитр глубокой пластине хорошо для опреснительного. После опреснивания комбинированных легких и тяжелых пептидов высушите пептиды и выполните изобариковые пометки.

Восстановить пептиды с 100 микролитров 100 миллимолярный буфер триэтилмония бикарбоната на орбитальном шейкере. Затем используйте 90 микролитров, чтобы аспирировать 25 микролитров комбинированных диметилированных пептидов и выдать их в первый ряд перерабатывающей пластины TMT. Загрузите один ряд из 90 микролитровых наконечников и аспирировать 10 микролитров TMT.

Разгрузите его в первом ряду перерабатывающей пластины TMT, разгрузите кончики, затем выполните тайминговый коктейль в течение одного часа при 1800 об/мин. Аспирировать восемь микролитров гидроксиламина из второго ряда пластины TEAB и раздать его грести один из TMT обработки пластины. После 15-минутного встряхивания при 1800 об/мин перенесите 30,5 микролитров пептидов СМТ в 1,5 миллилитровую трубку.

Затем приступайте к сбору и анализу данных в соответствии с рукописными указаниями. Здесь показаны репрезентативные данные MS пептида, идентифицированные во всех 22 ионных каналах репортера из изотопной маркировки 22 Plex. Последовательность пептида соответствует бетаин-гомоцистеин S-метилтрансферазе.

Наиболее интенсивные ионы фрагментов как для легких, так и для тяжелых диметилированных пиков были дополнительно изолированы для фрагментации MS3. Ионные интенсивности репортера прямо пропорциональны изобилию пептидов в образце. В целом, этот комбинированный изотопной маркировки прекурсоров и изотопных пометки эксперимент сократил время обработки образца и сделал возможным визуализировать выражение белка через несколько каналов или условий.

Коробка участок журнала 10 изобилия по сравнению с общей интенсивности ионов репортера во всех 22 каналов показывает меньшей межуголовной или меж образец изменчивости. Оценка общей автоматизации была сделана путем изучения ошибки в изобилии ионов репортера по каждому белку в 22 образцах. Обработка образцов с помощью роботизированной платформы привела к очень низким коэффициентам вариации.

По 3098 пептидам средний коэффициент вариации в изобилии ионов репортеров составил 12,36 и 15,03% для легких и тяжелых диметилированных пептидов соответственно. При попытке этого протокола важно иметь в виду, что изотопные и изобарические уровни используются в одном эксперименте. Таким образом, необходимо тщательное планирование для обозначения каждого образца с тегами, предназначенными для использования в эксперименте.

Этот метод может быть легко интегрирован в другие роботизированные системы, и он может быть применен к различным тканям, таким как ткани или клетки лисаты и другие биофлюиды.