Непрерывная видеоэлектроэнцефалограмма при гипоксии-ишемии у неонатальных мышей

Гипоксически-ишемическая энцефалопатия является наиболее частой причиной судорог у новорожденных. Эта мышиная модель гипоксических ишемических припадков и непрерывная видеоэлектроэнцефалография или ЭЭГ могут помочь нам лучше понять и охарактеризовать неонатальные судороги. Этот метод облегчает получение высококачественных видеозаписей электроэнцефалографии в модели неонатальной травмы и может помочь в будущих исследованиях механизмов неонатальных судорог, исходов и терапевтических испытаний.

Демонстрировать процедуру будет Правин Вагли. Специалист по лаборатории из моей лаборатории. Для операции по имплантации электродов.

После подтверждения отсутствия реакции на болевой рефлекс у обезболенной мыши на девятый день после родов поместите мышь в стереотаксическую стадию с носовым конусом и используйте обратную сторону ушной планки, чтобы удерживать голову в устойчивом положении. Простерилизуйте область разреза на черепе с помощью трех чередующихся скрабов с бетаином и 70% этанолом и используйте фенестрированную простыню, чтобы накрыть мышь, сохраняя при этом видимую область разреза. Вскройте переднюю заднюю часть головы немного над глазами и втяните примерно на полсантиметра кожи.

Расположите голову на стереотаксическом столике так, чтобы кожа вытягивалась наружу, обнажая череп, и с помощью ватного тампона нанесите перекись водорода. Используйте лезвие скальпеля, чтобы тщательно соскоблить череп. И нанесите на кость примерно 50 микролитров капли клея.

С помощью аппликатора распределите клей по черепу и поместите клей под ультрафиолетовым светом на 40 секунд. Когда клей схватится, измерьте координаты, используя экспонированную брегму в качестве эталона. И используйте иглу 32 калибра для создания отверстий для электродов двусторонне в области CA1 гиппокампа, двусторонне в теменной коре и в мозжечке.

Очистите кровь от поверхности черепа и с помощью стереотаксической руки опустите электроды, прикрепленные к разъему женской розетки, в мозг. Вживите каждый электрод в мозг и зафиксируйте электроды на месте стоматологическим акрилом. Приклейте гарнитуру к черепу с помощью дополнительного стоматологического акрила.

Подкожно вводите пять миллиграммов на килограмм кетопрофена каждому щенку. Когда все электроды будут закреплены хотя бы в половине помета, верните щенков матери. Через 24 часа после имплантации электродов поместите каждое животное в специально изготовленную плексигласовую камеру с температурой 37 градусов Цельсия для записи ЭЭГ и используйте гибкий кабель операционного усилителя для подключения щенков к системе видеомониторинга ЭЭГ.

Используйте многоканальный дифференциальный усилитель для оцифровки данных ЭЭГ на частоте 1000 Гц с коэффициентом усиления в один килограмм и просмотрите сигнал ЭЭГ в соответствующем программном обеспечении для анализа. Затем запишите базовую ЭЭГ до травмы в течение 30 минут, прежде чем отсоединить животных для процедуры судебного разбирательства по сонной артерии. После записи исходных данных ЭЭГ простерилизуйте кожу между нижней челюстью и ключицей на левой стороне шеи с помощью бетаина и этанола, как показано на рисунке.

И сделайте примерно один сантиметровый надрез с левой стороны шеи. Поместите щенка под препарирующий микроскоп и осторожно втяните подкожную клетчатку и кожу, чтобы обнажить сонную артерию. Подложите под артерию пятисантиметровый кусок стерильного шелкового шва.

Определите блуждающий нерв и деликатно отделите и оттяните нерв от артерии. Маневрируйте швом так, чтобы он находился только под артерией. После выявления блуждающего нерва деликатно отделите и отведите нерв от артерии и с помощью микрощипцов проденьте под артерию пятисантиметровый кусок стерильного шелкового шва.

Завяжите двойной узелковый шов вокруг артерии, чтобы перекрыть поток и разрезать лишний шов. Замените подкожную клетчатку и кожу над обнаженной артерией и используйте Vetbond для закрытия разреза. Затем поместите животное обратно на непрерывный мониторинг ЭЭГ в камеру комнатной температуры, положите на согревающий матрас и проведите выборочные инфракрасные проверки температуры тела щенка, чтобы избежать открытия камеры.

Дав щенкам восстановиться в течение одного часа с непрерывным мониторингом фракции вдыхаемого кислорода, промойте камеру 60 литрами в минуту 100% азота и 0,415 литрами в минуту 100% кислорода. Как только насыщение кислородом в камере достигнет 12%, уменьшите расход азота до 10 литров в минуту, сохраняя при этом поток кислорода неизменным. Внося небольшие коррективы по мере необходимости, поддерживайте долю вдыхаемого кислорода на уровне 8% в течение 45 минут.

После 45 минут воздействия гипоксии верните фракцию вдыхаемого кислорода до 21% и дайте детенышам восстановиться в камере с ЭЭГ-мониторингом в течение двух часов. По окончании периода записи отключите мышей от системы ЭЭГ и верните детенышей матери. Видеозаписи ЭЭГ позволяют соотносить электрографические данные с поведением на видео.

Большинство событий, наблюдаемых в этой модели, связаны с фокальным односторонним или смешанным поведением. В течение гипоксического периода подгруппа мышей обычно проявляет некомпульсивную судорожную активность, во время которой детеныши неподвижны с устойчивой судорожной активностью на ЭЭГ. В этом анализе исходная активность была аналогична ранее описанному фону у детенышей мышей P 10.

После судебного разбирательства и до начала гипоксии у подгруппы мышей наблюдались судорожные припадки. После индукции гипоксии амплитуда фона на ЭЭГ снижалась. Кроме того, наблюдались периодические всплески разрядов спайковых волн с последующим подавлением.

У мышей наблюдались электрографические припадки, которые возникают из подавленного фона в виде ритмичных спайковых волновых разрядов, которые прогрессировали, становясь более сложными и частыми с полиспиковыми волнами. Во время гипоксии анализ спектрограммы мощности отличается асимметрией между ишемическим и контралатеральным полушариями. Ишемическое полушарие демонстрирует паттерн подавления взрыва, а контралатеральное полушарие демонстрирует подавленный фон.

Во время повторной оксигенации и восстановления у подгруппы мышей продолжаются судороги в течение оставшегося периода регистрации. Фон ЭЭГ подавлен по сравнению с исходным уровнем после гипоксии с постепенным восстановлением, наблюдаемым в течение периода после регистрации гипоксии. При работе с неонатальными щенками точность является ключевым фактором.

Кроме того, особое внимание следует уделить размещению детенышей вместе с матерью в группах после хирургических процедур. Видеоэлектроэнцефалография может быть использована у новорожденных щенков в сочетании с гистопатологией, визуализацией и поведением для изучения влияния неонатальных судорог на хирургию травм и поведенческие исходы.