Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов

Этот протокол предназначен для расщепления целых глаз мыши в одноклеточную суспензию для многопараметрической проточной цитометрии мононуклеарных фагоцитов, которые включают макрофаги, моноциты, микроглию и дендритные клетки. Основным преимуществом данной методики является возможность использования количественного анализа с интенсивностью флуорофора для дифференцировки близкородственных типов клеток с помощью экспрессии маркеров клеточной поверхности. Наш протокол оптимизирован для анализа гетерогенности макрофагов, включая как резидентные, так и инфильтрирующие популяции в модели лазерно-индуцированной неоваскуляризации хориоидеи.

Тем не менее, эти концепции и методы могут быть в равной степени применены к другим моделям, таким как диабетическая ретинопатия, экспериментальный аутоиммунный увеит, а также проявления волчанки. При использовании этого протокола понимание конфигурации цитометра является важной отправной точкой, поскольку не все цитометры настроены одинаково. Таким образом, может потребоваться титрование объемов флуоресцентно конъюгированных антител и/или корректировка флуорофоров для оптимизации протокола в зависимости от конфигурации вашего цитометра.

Начните с подготовки буфера для разложения в соответствии с указаниями рукописи. С помощью диссекционного микроскопа и 10-кратного общего увеличения удалите оставшуюся конъюнктиву и зрительный нерв из глаз. Переместите чистые глаза в сухую препарирующую посуду или небольшую лодку для взвешивания, затем сделайте две перфорирующие раны с углом 90 градусов между ними через визуальную ось.

С помощью шприца с иглой 30 калибра введите от 0,15 до 0,2 миллилитров буфера для пищеварения в стекловидное тело каждого глаза. Измельчите глаза пружинными ножницами и тонкими щипцами, затем диссоциируйте ткань хрусталика с помощью тупого механического разрушения, чтобы предотвратить закупорку кончиков пипеток на последующих этапах. Промойте щипцы и ножницы 0,75 миллилитрами буфера для пищеварения и замените чашку на каждый образец.

С помощью пипетки P1000 перенесите содержимое чашки в диссоциационную трубку на льду, стараясь не потерять материал. Промойте посуду еще 1,5 миллилитрами буфера для пищеварения и добавьте его в диссоциационную трубку, доведя общий объем до 3,25-3,5 миллилитров. Диссоциируйте ткань на электронном диссоциаторе, как описано в рукописи текста, убедившись, что вся ткань находится на дне перевернутой диссоциационной трубки и контактирует с буфером для пищеварения.

Затем инкубируйте диссоциационную трубку при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение 30 минут. Повторите диссоциацию тканей еще два раза, инкубируя образец при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение 30 минут между диссоциациями. Чтобы остановить реакцию, добавьте 10 миллилитров буфера холодного потока и поместите пробирки с образцами на лед.

Чтобы создать одноклеточную суспензию, процедите остановленную реакцию пищеварения глаз через фильтр 40 микрометров, расположенный в верхней части конической центрифужной пробирки объемом 50 миллилитров. С помощью поршня из шприца объемом 2,5 миллилитра протолкните оставшиеся кусочки непереваренной ткани глаза через фильтр. Промойте диссоциационную трубку 10 миллилитрами проточного буфера и промойте фильтр.

Затем с помощью того же поршня снова пропустите непереваренные кусочки тканей глаза через фильтр. Повторите этот процесс с пятью миллилитрами буфера потока. Затем промойте диссоциационную трубку и профильтруйте последние 10 миллилитров проточного буфера.

Центрифугируйте коническую пробирку при 400 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и сцеживайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Разбейте шарик, прижав трубку к другой трубке. Затем добавьте один миллилитр лизирующего раствора и покрутите пробирку при комнатной температуре в течение 30 секунд, чтобы лизировать эритроциты.

Остановите реакцию с помощью 20 миллилитров проточного буфера и центрифугируйте коническую пробирку при 400-кратном перегрузке на 10 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Прижмите трубку к другой трубке.

Затем добавьте пять миллилитров холодного HBSS. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 0,5 миллилитра живого мертвого морилки в каждый образец с помощью пипетки P1000, убедившись, что гранула полностью диссоциирована.

Переложите образцы в пробирки с микротитром объемом 1,2 миллилитра и инкубируйте их в течение 15 минут в темноте. Тем временем посчитайте аликвоту в 10 микролитров образца с трипановым синим и гемоцитометром. После инкубации промойте каждый образец, добавив 400 микролитров буфера холодного потока.

Центрифугируйте пробирки в штативе для пробирок с микротитром при 400-кратном G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Полностью суспендируйте элементы в 500 микролитрах буфера холодного потока. Затем повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость.

Блокируйте до пяти миллионов живых клеток в 50 микролитрах FC-блока. Полностью диссоциируйте клеточную гранулу и инкубируйте ее при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Затем добавьте в каждый образец по 50 микролитров раствора для окрашивания антител.

Полностью перемешайте его и выдержите еще 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Здесь показаны свойства области прямого рассеяния в сравнении с областью бокового рассеяния для всех анализируемых событий от двух глаз одной мыши. Количество шариков было очищено и подтверждено путем построения графика ТЭЛА над APC-Cy7, что создало плотный кластер положительных и отрицательных событий APC-Cy7.

Далее были идентифицированы синглеты в живых клетках по всем событиям. Синглеты положительно коррелировали по высоте прямого рассеяния по отношению к площади прямого рассеяния, в то время как дублетные и триплетные ячейки имели большую площадь прямого рассеяния, чем высоту прямого рассеяния. Живые клетки являются положительными в области прямого рассеяния, а живые мертвецы — отрицательными.

Здесь показана первоначальная стратегия гейтирования для выделения мононуклеарных фагоцитов из живых синглетных клеток. Живые синглеты визуализировались с помощью графика CD45 и CD11b. Отсутствие CD45-положительных клеток в CD45 FMO подтвердило выбор гейта.

Затем нейтрофилы, эозинофилы, В-клетки и К-клетки, а также Т-клетки были исключены путем построения графиков CD45-положительных живых синглетов с линейным гейтом в сравнении с CD11b. CD45-дим-клетки дифференцировались от клеток с высоким уровнем CD45. Также были идентифицированы подмножества макрофагов.

Микроглия была выделена в клетках CD45-dim с CD64-положительным MHC2 низким окрашиванием. MHC2-отрицательные макрофаги были идентифицированы как CD64-положительные MHC2-отрицательные. CD11c-отрицательные и CD11c-положительные макрофаги были продемонстрированы как CD64-положительные CD11c-отрицательные.

и CD64-положительный CD11c-положительный в MHC2-положительных клетках. Было обнаружено, что лазерное лечение увеличивает количество MHC2-отрицательных, CD11c-отрицательных и CD11c-положительных макрофагов. Количество дендритных клеток также повышалось с помощью лазерного лечения, в то время как количество микроглии и моноцитов не влияло.

Системная перфузия не влияла на количество макрофагов. После этой процедуры сортировка клеток, активированных флоресценцией, а не только анализ, позволяет охарактеризовать гетерогенность макрофагов и ее влияние на функцию с помощью транскриптомных или протеомных исследований.