Трубопровод с использованием двустороннего в утробе матери электропорации для допроса генетического влияния на поведение грызунов

Использование этого метода может позволить выяснить, как определенные изменения экспрессии генов могут быть связаны с патологиями, связанными с неврологическими заболеваниями. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет избежать необходимости создания или покупки генетических линий животных, на создание и проверку которых могут уйти годы. Этот метод позволяет изучать гены, участвующие в неврологических расстройствах.

Определение того, как конкретные гены способствуют патологии, является важным шагом в разработке новых методов лечения. Преимущество этого протокола заключается в том, что экспериментатор учится манипулировать эмбрионами таким образом, чтобы он выполнил этап переноса генов без снижения выживаемости. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что эмбрионы очень хрупкие, поэтому полезно наблюдать, как опытный экспериментатор манипулирует ими во время процедуры.

Принесите беременных матерей в операционную зону не менее чем за 30 минут до операции. Стерилизуйте все место операции с помощью стерилизованных бактерицидных салфеток, а затем 70% этанола. Затем стерилизуйте автоклавные инструменты в стерилизаторе со стеклянными шариками.

Переложите стерильный PBS в конические пробирки объемом 50 миллилитров и поместите пробирки на водяную баню, нагретую до 38-40 градусов Цельсия. Проверьте температуру стерильного солевого раствора с помощью термометра. Включите циркуляционный насос нагрева воды, чтобы он нагрелся до 37 градусов по Цельсию.

Затем включите инжектор давления и электропоратор и убедитесь в правильной работе. Кратковременно раскрутите раствор плазменной ДНК на настольной центрифуге и поместите его на лед. Натяните стеклянные пипетки на съемник так, чтобы кончик вытягиваемой стеклянной пипетки был около 50 микрометров в диаметре.

Затем наполните пипетку от 20 до 40 микролитров раствора ДНК. Подготовьте все необходимые предметы для операции, включая лосьон для удаления волос, йод, 70% этанол, ватные палочки, глазные капли, швы и марлю. Подготовьте операционный лист и заполните необходимую информацию.

Взвесьте мышь перед операцией и запишите вес. После обезболивания мыши введите предоперационные анальгетики и удалите шерсть с живота с помощью крема для эпиляции или бритвы. Простерилизуйте брюшную полость, трижды протерев ее повидон-йодом и 70%-ным этанолом.

Создайте стерильное поле вокруг живота с помощью стерильной марли и драпировки. Сделайте разрез по средней линии на коже живота, одновременно поднимая кожу вверх щипцами, чтобы избежать разрезания мышцы. Затем поднимите мышцу вверх и разрежьте ее, стараясь не повредить жизненно важные органы.

Осторожно вытащите рога матки из плотины с помощью кольцевых щипцов и аккуратно положите их на стерильное поле, убедившись, что они поддерживаются набивкой и не тянут слишком далеко от плотины. Поддерживайте рот матки увлажненным на протяжении всей оставшейся операции с помощью предварительно подогретого стерильного PBS. Поместите эмбрион с помощью щипцов или пальцев, затем осторожно вставьте вытянутую стеклянную пипетку в боковую вертикаль и введите два-три микролитра в каждый желудочек, вставив пипетку в один, а затем в другой желудочек.

Желудочек был успешно направлен, если после инъекции присутствует форма полумесяца. Чтобы провести двустороннюю трансфекцию клеток в лобной коре, расположите два отрицательных электрода по бокам головы эмбриона сбоку и немного каудально по отношению к боковым желудочкам, а положительный электрод расположите между глазами прямо перед развивающейся мордой. Убедитесь, что эмбрион обильно увлажнен, и нанесите четыре квадратных импульса.

Вводите и электропорируйте все эмбрионы, делая это один за другим, чтобы каждый эмбрион был электропорирован сразу после введения раствора ДНК. После того, как все эмбрионы будут подвергнуты электропоре, осторожно введите маточные рога обратно в брюшную полость. Покройте брюшную полость стерильным PBS, чтобы облегчить размещение маточного рога.

Заполните брюшную полость стерильным PBS так, чтобы после наложения швов не осталось воздушных карманов. Сшить мышцу рассасывающимися нитями и кожу шелковыми нерассасывающимися швами. Дайте плотине полностью восстановиться в нагретой камере не менее одного часа.

Регулярно проверяйте плотины в течение следующих 48 часов. Когда дама оправится от анестезии и придет в сознание, она начнет двигаться и взбиваться. Этот метод был использован для трансфекции примерно 5000 пирамидных нейронов слоя 2/3 плазмидой pCAG-GFP.

Большая часть этих клеток была локализована в лобных областях коры головного мозга. Репрезентативный пример показывает ростральное каудальное распределение трансфицированных нейронов у взрослой контрольной мыши, подтверждая способность двусторонних ВМИ нацеливаться и генетически помечать большие популяции пирамидальных нейронов в лобной коре. Первая часть задания на взаимодействие с матерью проверяет способность контрольных мышей, трансфицированных P18, находить подстилку для гнезда.

Контрольные мыши тратили больше времени на изучение подстилки своего гнезда, чем на изучение свежей подстилки, что говорит о том, что у них неповрежденные сенсорно-моторные способности и исследовательское поведение. Вторая часть задания использует тенденцию мышей быть мотивированными к взаимодействию со своей матерью. В этой задаче щенки проводили большую часть времени рядом с матерью, в то время как значительно меньше времени тратили на изучение пустой чашки или подстилки для гнезда.

Взрослые контрольные мыши тратили примерно 35% времени на изучение нового объекта. Когда взрослым мышам показывали новый и знакомый объект, они проводили больше времени, исследуя новый объект. В задаче на общительность взрослые мыши потратили одинаковое количество времени, исследуя новую мышь и пустую чашку.

Это поведение автоматически отслеживалось с помощью программного обеспечения DeepLabCut путем маркировки различных точек на мыши, включая конечности, центроид, голову и уши. Программное обеспечение также использовалось для определения того, когда мыши вставали на дыбы, изучая длину тела мыши, поскольку это расстояние становится короче, когда мышь вставает на дыбы. После этой процедуры можно получить ответы на многие клеточные молекулярные вопросы, исследуя ткань и анализируя различные показатели, такие как плотность позвоночника или уровни экспрессии различных белков.