Самосвечение гамма-модифицированных пептидных нуклеиновых кислот в сложные наноструктуры в органических растворителях
June 26th, 2020
В данной статье приводятся протоколы проектирования и самосверки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептидной нуклеиновой кислоты в органических растворителях.
Этот новый протокол описывает использование нескольких различных последовательностей синтетической нуклеиновой кислоты имитировать гамма PNA для формирования наноструктур в конкретных органических смесей растворителя. Описанные здесь анализы свидетельствуют о необходимости адаптации существующих протоколов нуклеиновой кислоты к органическим растворителям, в которых практически не было опубликовано протоколов. Практикующим, новым для этого метода, может быть трудно адаптировать существующие протоколы, разработанные для богатых aqueous сред в органических богатых растворителями средах из-за склонности наноматериалов PNA к агрегировать.
Начните с подготовки гамма PNA запасов. После получения HPLC класса очищенных гамма PNA нитей от коммерческого производителя, повторно каждую прядь в деионизированной воде до 300 микромоляных концентраций. Храните гамма-ПНА при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
Когда готовы к самостоятельной сборке, подготовить аннеальные образцы партии в 75%DMSO, 75%DMF, и 40%1, 4-диоксан. Во-первых, подготовить 20 микромоляных подстоков каждого олигомера путем алицитирования 0,67 микролитров из основного запаса и добавления деионизированной воды для конечного объема в 10 микролитров. Добавьте один микролитр каждого олигомера из 20 микромоляных подстоков в 200 микролитров ПЦР-трубки, которые будут иметь общий объем в девять микролитров для девяти олигомеров.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO или DMF с дополнительным одним микролитером деионизированной воды для конечного объема 40 микролитров. Для приготовления 40%1, 4-диоксана партии, добавить 16 микролитров 1, 4-диоксан и довести объем до 40 микролитров с деионизированной водой. Аннеал образцы в течение 22,5 часов в тепловой циклер охлаждения от 90 до 20 градусов по Цельсию.
Как правило, температуры плавления, полученные для двух олигомеров и трех олигомерных гамма-подмножего PNA, находятся в диапазоне от 40 до 70 градусов по Цельсию при различных условиях растворителя. Запрограммировать тепловой циклер в соответствии с рукописными указаниями. После того, как annealing завершена, образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов до характеристики.
Сделайте камеру влажности из пустой коробки советы пипетки, заполнив коробку с примерно пятью миллилитров воды. Подготовка 20-кратное разбавление коммерчески доступных 2%collodion в ацетате амила с растворителем изоамил ацетата для создания раствора нитроцеллюлозы. Используйте пинцет, чтобы окунуть крышку в раствор нитроцеллюлозы и позволить ему высохнуть в воздухе, а затем сделать камеру потока из микроскопа слайд, две двусторонние ленточных полос, и нитроцеллюлозы покрытием крышки.
Подготовьте раствор биотина BSA, взвесив один миллиграмм биотина BSA и растворив его в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров биотина BSA в канал потока под углом и инкубировать его в течение двух-четырех минут при комнатной температуре во влажной камере. Удар 15 микролитров буфера мытья, который состоит из одного миллиграмма BSA в один миллилитр PBS, в канал, чтобы смыть избыток биотина BSA, а затем пассивировать поверхность путем инкубации канала потока в течение двух-четырех минут во влажной камере.
Измерьте 0,5 миллиграмма стрептавидина и один миллиграмм BSA, затем растворите оба в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров раствора стрептавидина в канал потока и поместите его в увлажненной камере в течение двух-четырех минут и мыть канал, вытекающих 15 микролитров мыть буфера. Далее, поток 15 микролитров аннулированной партии гамма PNA олигомеров во влажной камере, а затем мыть несырь наноструктур, вытекающих 15 микролитров одного миллимолярный Trolox в том же составе растворителя, как наноструктуры.
Перенесите канал потока на держатель слайда и извещаете его с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного изображением TIRF, целью погружения в масло 60X и 1,5-х magnifier. Сканирование канала потока на 60 или 90X увеличение при мониторинге канала Cy3. Подготовьте 20 и 6%SDS запасов в соответствии с рукописными указаниями, а затем аннеал гамма PNA олигомеры, добавив один микролитр из каждых 20 микромолейных олигомеров в 200 микролитров ПЦР трубки.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO и один микролитр 6%или 20% SDS в трубки ПЦР для конечного объема 40 микролитров, что приведет к окончательной концентрации SDS 5,25 или 17,5 миллимолейра соответственно. Аннеал гамма-ПНА в термоциклере, как описано ранее. Характеризуйте гамма-наноструктуры PNA в присутствии SDS с помощью протокола TIRF или TEM.
TIRF изображения гамма PNA олигомеры annealed в 75%DMSO показали хорошо организованные архитектуры в то время как annealing в 75%DMF привело к пряной формы или иглы, как наноструктуры. Состояние 40%1, 4-диоксана произвело редкое украшение нитей наноструктур. Кроме того, образцы гамма-нанотрубок PNA, образованные в 75% DMSO, продемонстрировали комплектацию нановофибер при высоком увеличении или наноскопических разрешениях во время визуализации TEM.
Количественный анализ ширины наноструктур показал медианную ширину 16,3 нанометров с максимальными значениями за 80 нанометров. Isosequential ДНК олигомеры, которые заменили смежных гамма-ПНА формируется прямой нити структур в то время как замена кроссовер гамма-ПНА привести к stellate структур. Наноструктуры, которые были заменены смежными олигомерами ДНК, имели среднюю ширину около 19 нанометров.
При высоких концентрациях SDS, гамма PNA нановобры также принять высоко сетевой морфологии по сравнению с его критических концентраций micelle при просмотре с TIRF изображений. TEM изображения показывают, что гамма PNA сборки в 5,25 миллимоляров SDS имеет наиболее существенное сокращение структурных комплектации. При попытке этого протокола, важно помнить, чтобы сохранить состав растворителя, как уже упоминалось из-за склонности наноструктур к агрегировать.
Эти методы побуждают практикующих преследовать другие неизведанные пути различных растворителей, сурфактантов и других наноструктур ДНК PNA.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлены протоколы для проектирования и самосборки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептидной нуклеиновой кислоты в смесях органических растворителей. Новый протокол акцентирует внимание на адаптации существующих протоколов нанотехнологии нуклеиновых кислот для использования в органических растворителях.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нанотехнологии
- Биохимия
- Органическая химия
Фон
- Gamma PNA — это синтетический миметический аналог нуклеиновой кислоты.
- Существующие протоколы в основном разработаны для водных сред.
- Органические растворители представляют уникальные трудности для формирования наноструктур.
- Агрегация PNA в органических растворителях может усложнить эксперименты.
Цель исследования
- Предоставить протокол для формирования наноструктур с использованием гамма PNA.
- Решить проблему отсутствия опубликованных протоколов для органических сред.
- Помочь практикам в адаптации существующих методов.
Используемые методы
- Приготовление запасов гамма PNA из очищенных нитей HPLC-класса.
- Пересуспензирование нитей PNA в деионизированной воде до определенных концентраций.
- Хранение гамма PNA при минус 20 градусах Цельсия.
- Проведение анализов для оценки самосборки в органических растворителях.
Основные результаты
- Демонстрируется успешное формирование наноструктур в органических растворителях.
- Подчеркивается важность адаптации протоколов для неводных сред.
- Определяются трудности, связанные с агрегацией PNA.
- Предоставляется основа для будущих исследований в области нанотехнологии нуклеиновых кислот.
Выводы
- Исследование представляет жизнеспособный метод использования гамма PNA в органических растворителях.
- Оно побуждает к дальнейшему изучению технологий нуклеиновых кислот в различных средах.
- Будущие исследования могут расширить результаты для оптимизации применения наноструктур.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables the self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acid (γPNA) nanostructures in organic solvent mixtures, addressing a critical gap in nucleic acid nanotechnology for non-aqueous environments. By demonstrating programmable assembly of addressable single-stranded tiles into micron-scale nanofibers, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery where aqueous-incompatible assays or screening campaigns require organic solvent compatibility. The inclusion of surfactant-mediated bundling control provides a tunable parameter for optimizing nanostructure morphology, enhancing reproducibility in downstream biophysical or imaging applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nucleic acid-like recognition in organic solvents, supporting target hypothesis testing where traditional aqueous probes fail due to solubility or stability constraints.
- Operational Value: Provides a standardized scaffold for presenting ligands or capturing analytes in solvent conditions relevant to membrane-associated targets or lipid-based assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates addressable, single-stranded tile arrays with programmable binding domains for multiplexed target engagement in organic media.
- Operational Value: Yields nanostructures with quantifiable width distributions (median 16.3 nm, max >80 nm) enabling calibration of imaging or detection platforms in non-aqueous formats.
- Scientific Value: Demonstrates surfactant-dependent morphology control (e.g., SDS reducing bundling), allowing assay optimization to minimize false signals from aggregation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates structure-activity studies of γPNA analogs in solvent systems mimicking intracellular or microenvironmental conditions, supporting translational biomarker exploration.
- Operational Value: Enables longitudinal stability assessment of nanostructures under storage conditions (4°C for 12–24 hours post-annealing), informing reagent handling in preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement must be assessed in organic solvent mixtures, such as lipid-soluble compound screening or membrane protein assays, prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via programmable γPNA tile assembly, enabling de-risking of targets that are inaccessible to aqueous nucleic acid probes.
- Screening: Generates reproducible nanofiber templates for presenting capture molecules in solvent conditions compatible with hydrophobic compound libraries.
- Analytics: Provides measurable outputs (nanofiber width, bundling degree, morphology via TIRF/TEM) for comparing assembly conditions and quantifying structural consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing evaluation of γPNA nanostructures in solvent systems relevant to tissue penetration or subcellular localization studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, sequence-agnostic platform for γPNA-based nanostructure fabrication, adaptable across multiple targets without re-engineering core assembly logic.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in nanostructure formation through solvent-specific annealing protocols and surfactant titration, reducing mechanistic ambiguity in non-aqueous recognition events.
- Operational Value: Standardized stock preparation (300 μM in water, −20°C storage) and defined annealing cycles (22.5 hours, 90°C to 20°C) ensure reproducibility across sites and teams.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions for targets requiring organic solvent compatibility, reducing late-stage failure risk from assay-context mismatch.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of screening campaigns by providing a validated method to assess target engagement in physiochemically relevant milieus.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid nanotechnology and solvent handling, particularly for anhydrous DMSO, DMF, and 1,4-dioxane mixtures.
- Depends on access to thermal cyclers with programmable annealing, fluorescence/TIRF microscopes, and TEM for characterization.
- Necessitates standardization of surfactant concentrations (e.g., 5.25 mM or 17.5 mM SDS) to control bundling, as variability directly impacts nanostructure width and morphology.
- Requires adaptation across model systems due to γPNA’s aggregation propensity in organic solvents, necessitating empirical optimization of solvent ratios and annealing profiles.
- Practical limitation: Nanostructure stability is time-sensitive (12–24 hours at 4°C post-annealing), requiring tight coordination between assembly and imaging to avoid degradation or aggregation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Self-assembly Protocol for Multiple Distinct PNA Oligomers
2:48
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy Imaging
5:08
Different Morphologies for PNA Nanofibers in Varying Concentrations of SDS
6:01
Results: TIRF and TEM Imaging of PNA Nanofibers
7:41
Conclusion
