Самосвечение гамма-модифицированных пептидных нуклеиновых кислот в сложные наноструктуры в органических растворителях
26 июня 2020 г.
В данной статье приводятся протоколы проектирования и самосверки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептидной нуклеиновой кислоты в органических растворителях.
Этот новый протокол описывает использование нескольких различных последовательностей синтетической нуклеиновой кислоты имитировать гамма PNA для формирования наноструктур в конкретных органических смесей растворителя. Описанные здесь анализы свидетельствуют о необходимости адаптации существующих протоколов нуклеиновой кислоты к органическим растворителям, в которых практически не было опубликовано протоколов. Практикующим, новым для этого метода, может быть трудно адаптировать существующие протоколы, разработанные для богатых aqueous сред в органических богатых растворителями средах из-за склонности наноматериалов PNA к агрегировать.
Начните с подготовки гамма PNA запасов. После получения HPLC класса очищенных гамма PNA нитей от коммерческого производителя, повторно каждую прядь в деионизированной воде до 300 микромоляных концентраций. Храните гамма-ПНА при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
Когда готовы к самостоятельной сборке, подготовить аннеальные образцы партии в 75%DMSO, 75%DMF, и 40%1, 4-диоксан. Во-первых, подготовить 20 микромоляных подстоков каждого олигомера путем алицитирования 0,67 микролитров из основного запаса и добавления деионизированной воды для конечного объема в 10 микролитров. Добавьте один микролитр каждого олигомера из 20 микромоляных подстоков в 200 микролитров ПЦР-трубки, которые будут иметь общий объем в девять микролитров для девяти олигомеров.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO или DMF с дополнительным одним микролитером деионизированной воды для конечного объема 40 микролитров. Для приготовления 40%1, 4-диоксана партии, добавить 16 микролитров 1, 4-диоксан и довести объем до 40 микролитров с деионизированной водой. Аннеал образцы в течение 22,5 часов в тепловой циклер охлаждения от 90 до 20 градусов по Цельсию.
Как правило, температуры плавления, полученные для двух олигомеров и трех олигомерных гамма-подмножего PNA, находятся в диапазоне от 40 до 70 градусов по Цельсию при различных условиях растворителя. Запрограммировать тепловой циклер в соответствии с рукописными указаниями. После того, как annealing завершена, образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение 12 до 24 часов до характеристики.
Сделайте камеру влажности из пустой коробки советы пипетки, заполнив коробку с примерно пятью миллилитров воды. Подготовка 20-кратное разбавление коммерчески доступных 2%collodion в ацетате амила с растворителем изоамил ацетата для создания раствора нитроцеллюлозы. Используйте пинцет, чтобы окунуть крышку в раствор нитроцеллюлозы и позволить ему высохнуть в воздухе, а затем сделать камеру потока из микроскопа слайд, две двусторонние ленточных полос, и нитроцеллюлозы покрытием крышки.
Подготовьте раствор биотина BSA, взвесив один миллиграмм биотина BSA и растворив его в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров биотина BSA в канал потока под углом и инкубировать его в течение двух-четырех минут при комнатной температуре во влажной камере. Удар 15 микролитров буфера мытья, который состоит из одного миллиграмма BSA в один миллилитр PBS, в канал, чтобы смыть избыток биотина BSA, а затем пассивировать поверхность путем инкубации канала потока в течение двух-четырех минут во влажной камере.
Измерьте 0,5 миллиграмма стрептавидина и один миллиграмм BSA, затем растворите оба в одном миллилитре PBS. Пипетка 15 микролитров раствора стрептавидина в канал потока и поместите его в увлажненной камере в течение двух-четырех минут и мыть канал, вытекающих 15 микролитров мыть буфера. Далее, поток 15 микролитров аннулированной партии гамма PNA олигомеров во влажной камере, а затем мыть несырь наноструктур, вытекающих 15 микролитров одного миллимолярный Trolox в том же составе растворителя, как наноструктуры.
Перенесите канал потока на держатель слайда и извещаете его с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного изображением TIRF, целью погружения в масло 60X и 1,5-х magnifier. Сканирование канала потока на 60 или 90X увеличение при мониторинге канала Cy3. Подготовьте 20 и 6%SDS запасов в соответствии с рукописными указаниями, а затем аннеал гамма PNA олигомеры, добавив один микролитр из каждых 20 микромолейных олигомеров в 200 микролитров ПЦР трубки.
Добавьте 30 микролитров ангидроуса DMSO и один микролитр 6%или 20% SDS в трубки ПЦР для конечного объема 40 микролитров, что приведет к окончательной концентрации SDS 5,25 или 17,5 миллимолейра соответственно. Аннеал гамма-ПНА в термоциклере, как описано ранее. Характеризуйте гамма-наноструктуры PNA в присутствии SDS с помощью протокола TIRF или TEM.
TIRF изображения гамма PNA олигомеры annealed в 75%DMSO показали хорошо организованные архитектуры в то время как annealing в 75%DMF привело к пряной формы или иглы, как наноструктуры. Состояние 40%1, 4-диоксана произвело редкое украшение нитей наноструктур. Кроме того, образцы гамма-нанотрубок PNA, образованные в 75% DMSO, продемонстрировали комплектацию нановофибер при высоком увеличении или наноскопических разрешениях во время визуализации TEM.
Количественный анализ ширины наноструктур показал медианную ширину 16,3 нанометров с максимальными значениями за 80 нанометров. Isosequential ДНК олигомеры, которые заменили смежных гамма-ПНА формируется прямой нити структур в то время как замена кроссовер гамма-ПНА привести к stellate структур. Наноструктуры, которые были заменены смежными олигомерами ДНК, имели среднюю ширину около 19 нанометров.
При высоких концентрациях SDS, гамма PNA нановобры также принять высоко сетевой морфологии по сравнению с его критических концентраций micelle при просмотре с TIRF изображений. TEM изображения показывают, что гамма PNA сборки в 5,25 миллимоляров SDS имеет наиболее существенное сокращение структурных комплектации. При попытке этого протокола, важно помнить, чтобы сохранить состав растворителя, как уже упоминалось из-за склонности наноструктур к агрегировать.
Эти методы побуждают практикующих преследовать другие неизведанные пути различных растворителей, сурфактантов и других наноструктур ДНК PNA.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены протоколы проектирования и самосборки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептино-нуклеиновых кислот в смесях органических растворителей. Новый протокол делает акцент на адаптации существующих методов нанотехнологии нуклеиновых кислот для применения в органических растворителях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нанотехнологии
- Биохимия
- Органическая химия
Теоретические основы
- Gamma-PNA представляет собой синтетический миметик нуклеиновых кислот.
- Существующие протоколы разработаны преимущественно для водных сред.
- Органические растворители создают особые трудности для формирования наноструктур.
- Агрегация PNA в органических растворителях может осложнить проведение экспериментов.
Цель исследования
- Представить протокол формирования наноструктур с использованием гамма-ПНА.
- Устранить недостаток опубликованных протоколов для сред с органическими растворителями.
- Помочь специалистам в адаптации существующих методик.
Используемые методы
- Приготовление стоковых растворов гамма-PNA из очищенных нитей степени чистоты HPLC.
- Ресуспензия нитей PNA в деионизированной воде до достижения определенных концентраций.
- Хранение гамма-PNA при температуре -20 °C.
- Проведение анализов для оценки самосборки в органических растворителях.
Основные результаты
- Продемонстрировано успешное формирование наноструктур в органических растворителях.
- Подчеркнута важность адаптации протоколов для неводных сред.
- Выявлены проблемы, связанные с агрегацией PNA.
- Создана основа для дальнейших исследований в области нанотехнологий нуклеиновых кислот.
Выводы
- В исследовании представлен эффективный метод использования гамма-PNA в органических растворителях.
- Оно стимулирует дальнейшее изучение технологий на основе нуклеиновых кислот в различных средах.
- Будущие работы могут быть направлены на развитие полученных результатов для оптимизации применения наноструктур.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет осуществлять самосборку наноструктур из гамма-модифицированных пептидных нуклеиновых кислот (γPNA) в смесях органических растворителей, восполняя критический пробел в нанотехнологиях нуклеиновых кислот для неводных сред. Демонстрируя программируемую сборку адресуемых одноцепочечных плиток в нановолокна микронного масштаба, этот метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска, когда анализы, несовместимые с водной средой, или кампании по скринингу требуют совместимости с органическими растворителями. Использование контроля объединения в пучки с помощью поверхностно-активных веществ обеспечивает настраиваемый параметр для оптимизации морфологии наноструктур, что повышает воспроизводимость в последующих биофизических исследованиях или приложениях по визуализации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы распознавания по типу нуклеиновых кислот в органических растворителях, что способствует проверке гипотез в случаях, когда традиционные водные зонды оказываются неприменимы из-за ограничений по растворимости или стабильности.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный каркас для предъявления лигандов или захвата аналитов в условиях растворителей, соответствующих мембранным мишеням или анализам на основе липидов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание адресуемых массивов одноцепочечных плиток с программируемыми связывающими доменами для мультиплексного взаимодействия с мишенями в органических средах.
- Практическая ценность: Получение наноструктур с количественно определяемым распределением по ширине (медиана 16,3 nm, макс. >80 nm), что позволяет проводить калибровку платформ визуализации или детектирования в небазовых водных форматах.
- Научная ценность: Демонстрация контроля морфологии в зависимости от ПАВ (например, снижение агрегации с помощью SDS), что позволяет оптимизировать анализ для минимизации ложных сигналов, вызванных агрегацией.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает проведение исследований зависимости «структура — активность» аналогов γPNA в системах растворителей, имитирующих внутриклеточные условия или условия микроокружения, что способствует поиску трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдную оценку стабильности наноструктур в условиях хранения (4°C в течение 12–24 часов после отжига), что дает важную информацию о правилах обращения с реагентами в доклинических рабочих процессах.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод подходит для рабочих процессов на ранних этапах поиска, когда необходимо оценить связывание с мишенью в смесях с органическими растворителями, например, при скрининге жирорастворимых соединений или в анализах мембранных белков, до этапа идентификации ведущих соединений.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез посредством программируемой сборки плиток γPNA, что позволяет снизить риски при работе с мишенями, недоступными для водных зондов на основе нуклеиновых кислот.
- Скрининг: Создает воспроизводимые нановолоконные шаблоны для представления захватывающих молекул в условиях растворителей, совместимых с библиотеками гидрофобных соединений.
- Аналитика: Обеспечивает измеримые результаты (ширина нановолокон, степень объединения в пучки, морфология с помощью TIRF/TEM) для сравнения условий сборки и количественной оценки структурной согласованности.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническим этапом, позволяя оценивать наноструктуры γPNA в системах растворителей, актуальных для исследований проникновения в ткани или субклеточной локализации.
- Корпоративное повторное использование: Создает модульную, независимую от последовательности платформу для изготовления наноструктур на основе γPNA, адаптируемую под несколько мишеней без переработки основной логики сборки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Предсказательная уверенность в формировании наноструктур за счет использования протоколов отжига с учетом специфики растворителя и титрования сурфактантов, что снижает неопределенность механизмов процессов распознавания в неводных средах.
- Практическая ценность: Стандартизированный способ приготовления стоковых растворов (300 μM в воде, хранение при −20°C) и определенные циклы отжига (22,5 часа, от 90°C до 20°C) обеспечивают воспроизводимость результатов в разных лабораториях и группами исследователей.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о целесообразности работы с мишенями, требующими совместимости с органическими растворителями, снижая риск неудач на поздних этапах из-за несоответствия условий анализа контексту исследования.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию кампаний по скринингу с учетом рисков, предоставляя валидированный метод оценки взаимодействия с мишенью в физико-химически релевантных средах.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области нанотехнологий нуклеиновых кислот и навыками обращения с растворителями, в частности с безводными смесями DMSO, DMF и 1,4-диоксана.
- Зависит от наличия доступа к амплификаторам с программируемым отжигом, флуоресцентным/TIRF-микроскопам и ПЭМ для характеризации.
- Необходима стандартизация концентраций поверхностно-активных веществ (например, 5.25 mM или 17.5 mM SDS) для контроля агрегации в пучки, так как вариабельность напрямую влияет на ширину и морфологию наноструктур.
- Требуется адаптация для различных модельных систем из-за склонности γPNA к агрегации в органических растворителях, что обуславливает необходимость эмпирической оптимизации соотношений растворителей и профилей отжига.
- Практическое ограничение: стабильность наноструктур ограничена по времени (12–24 часов при 4°C после отжига), что требует четкой координации процессов сборки и визуализации во избежание деградации или агрегации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Self-assembly Protocol for Multiple Distinct PNA Oligomers
2:48
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy Imaging
5:08
Different Morphologies for PNA Nanofibers in Varying Concentrations of SDS
6:01
Results: TIRF and TEM Imaging of PNA Nanofibers
7:41
Conclusion
