Характеристика иммунных клеток и провоспалительных медиаторов в легочной среде

Этот протокол может быть использован для исследования изменений в легочной среде после ишемического инсульта. Этот метод позволяет идентифицировать 13 типов иммунных клеток легких и 13 различных цитокинов и хемокинов у одной и той же мыши с помощью проточного цитометрического анализа. Этот метод был использован для оценки изменений в легочной среде после ишемического инсульта.

Тем не менее, он также может служить для исследования изменений во время аллергической реакции или инфекции. Чтобы выполнить транскардиальную перфузию всего тела, подтвердите отсутствие реакции на педальный рефлекс у мыши, находящейся под наркозом, и закрепите мышь на хирургической платформе. Смочите шерсть с 70% этанолом, чтобы уменьшить распространение шерсти в полости тела, и сделайте вертикальный разрез кожи по средней линии, чтобы обнажить неповрежденную брюшину, прекратив разрез, как только будет достигнута грудная полость.

С помощью тонких диссекционных ножниц сделайте разрез брюшины по средней линии, предварительно остановившись на грудной полости, и с помощью щипцов захватите дистальный конец грудины. Используйте ножницы, чтобы разрезать диафрагму, не повреждая сердце, легкие или сосуды. Когда будут видны подлежащие ткани, сделайте разрез через грудную клетку и закрепите боковые стороны ребер так, чтобы сердце и легкие были полностью открыты.

Осторожно сделайте небольшой разрез в правом предсердии рядом с дугой аорты, чтобы он служил оттоком для перфузии, и быстро, но аккуратно введите иглу 25 калибра в дистальную верхнюю поверхность левого желудочка. Как только игла будет на месте, осторожно введите 10 миллилитров холодного PBS в сердце. Ткань должна начать очищаться от крови.

Когда весь объем будет доставлен, перфузируйте вторую 10 миллилитровую аликвоту холодного PBS до тех пор, пока печень не приобретет светло-коричневый вид, а легкие не изменят свой красновато-розовый цвет на преимущественно белый. Используя щипцы и ножницы для тонкого препарирования, осторожно удалите все окружающие ткани, прежде чем отделить доли легких и поместить их в чашку Петри, содержащую от одного до двух миллилитров холодной клетки легких, средней на льду. Чтобы подготовить легочную ткань для мультиплексных шариков, добавьте 200 микролитров холодного гомогенизационного буфера в двухмиллилитровую пробирку, содержащую три стерильных 2,3 миллилитровых шарика диоксида циркония/диоксида кремния, и взвесьте интересующую долю легкого.

Перенесите от 50 до 100 мг легочной ткани в предварительно охлажденную трубку с шариками и гомогенизационный буфер и гомогенизируйте долю с помощью гомогенизатора на основе гранул со скоростью 4000 оборотов в минуту в течение не менее двух минут. Когда ткань будет полностью гомогенизирована, центрифугируйте пробирку, чтобы осадить ткань, и перенесите супернатант в предварительно охлажденную микропробирку объемом 1,5 миллилитра на льду. Для диссоциации легочной ткани осторожно сцедите среду клеток легких из оставшейся доли легкого и введите в ткань иглу 25 калибра.

Введите от 200 до 250 микролитров диссоциативного буфера в каждую долю легкого, чтобы надуть легкие, пока каждая из долей не будет введена два-три раза. После двухминутной инкубации при комнатной температуре с помощью тонких ножниц для препарирования измельчите легкие на мелкие кусочки и переложите тканевый раствор в 15-миллилитровую летописную пробирку. Добавьте к образцу шесть миллилитров дополнительного буфера диссоциации и энергично вихревите в течение одной минуты.

Затем инкубируйте кусочки ткани в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, вортексируя каждые семь-восемь минут. В конце инкубации энергично перебейте образец в течение одной минуты и пропустите образец через сетчатый фильтр для клеток размером 100 микрон, чтобы удалить любые остаточные нежелательные соединительные и интерстициальные ткани. Соберите ткань центрифугированием и повторно суспендируйте в гранулу с пятью миллилитрами холодной легочной среды.

Снова центрифугируйте образец и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре холодной легочной среды с мягким вортексом. Затем отфильтруйте клетки через ситечко 100 микрон перед подсчетом. Чтобы оценить популяции иммунных клеток в изолированной легочной ткани, засейте антитела от 10 до 6 раз в 10-шестую силовые клетки, поместите их в соответствующее количество лунок с круглой нижней пластиной на 96 лунок и поместите клетки на дно пластины путем центрифугирования.

Добавьте 25 микролитров соответствующего коктейля антител в холодном буфере FACS в каждую лунку и перемешайте, нежно поглаживая трубкой. Через 20 минут повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах холодного буфера FACS на лунку и перенесите образцы в отдельные пятимиллилитровые полистирольные пробирки с круглым дном, содержащие 150 микролитров дополнительного буфера FACS на пробирку. Затем немедленно проанализируйте образцы на проточном цитометре в соответствии со стандартными протоколами проточного цитометрического анализа.

В этом репрезентативном анализе было идентифицировано 13 различных популяций иммунных клеток в легких с использованием трех наборов из пяти-семи комбинаций антител. Мертвые клетки были исключены с помощью окрашивания живым мертвецом, а различные типы иммунных клеток были выделены с помощью антител и маркеров, перечисленных в таблице. В первом наборе были идентифицированы альвеолярные и интерстициальные макрофаги, CD103-положительные и CD11B-положительные дендритные клетки и эозинофилы.

Провоспалительные моноциты и нейтрофилы были идентифицированы во втором наборе, а CD4-положительные и CD8-положительные Т-клетки, В-клетки, плазмоцитоидные дендритные клетки, NK-клетки и NKT-клетки были идентифицированы в третьем наборе. Общее количество жизнеспособных клеток, процентное содержание CD45-положительных клеток и общее количество полученных CD45-положительных клеток были одинаковыми между клеточными популяциями, которые были выделены, как показано, и клеточными популяциями, которые были выделены с помощью коммерчески доступного тканевого диссоциатора. Кроме того, процент гибели клеток среди CD45-положительных клеток составил менее 10% для обоих протоколов, что позволяет предположить, что продемонстрированный протокол способствует высокопродуктивному восстановлению клеток высокого качества без помощи автоматического диссоциатора тканей.

Кроме того, использование коммерчески доступного мультиплексного анализа в сочетании с проточным цитометрическим анализом позволяет определить концентрацию хемокина в каждом образце на миллиграмм ткани. Концентрация коллагеназы D, время инкубации и температура, используемые во время выделения одиночных клеток, оказывают решающее влияние на восстановление иммунных клеток.