Биофункционализация магнитных наноматериалов
16 июля 2020 г.
В данной работе представлен протокол биофункционализации магнитных наноматериалов с антителами для специфического клеточного таргетирования. Например, мы используем железные нанопроволоки для нацеливания на раковые клетки.
Ключевая особенность этого протокола в том, что он может быть применен к широкому спектру наноматериалов оксида железа. Кроме того, его можно применять на многосегментных наноматериалах, таких как железо-золотые нанопроволоки. Этот протокол может быть безопасно выполнен в любой стандартной биологической лаборатории.
Основным преимуществом этого метода биофункционализации является возможность получения специально направленного наноматериала на основе прочной ковалентной связи между нанопроволокой и антителами. Начните с резки алюминиевых дисков на мелкие кусочки с помощью однолезвийного лезвия и небольшого молотка. Поместите нарезанные части в двухмиллилитровую трубку и заполните ее одним миллилитром одномолярного гидроксида натрия, убедившись, что все алюминиевые части покрыты.
Оставьте пробирку при комнатной температуре в вытяжном шкафу для химикатов на 30 минут. После инкубации удалите кусочки алюминия пинцетом и подержите высвободившиеся нанопроволоки в гидроксиде натрия еще 30 минут. Поместите пробирку в магнитную сухую решетку, подождите две минуты и замените раствор свежим гидроксидом натрия.
Проведите ультразвуковую обработку двухмиллилитровой трубки нанопроволокой в течение 30 секунд и оставьте ее на один час в вытяжном шкафу для химикатов. Повторите этот шаг не менее четырех раз. Когда закончите, поместите двухмиллилитровую трубку в магнитную стойку, выбросьте гидроксид натрия и замените его одним миллилитром абсолютного этанола.
Обрабатывайте нанопроволоки ультразвуком в течение 30 секунд, поместите трубку в магнитную стойку и замените этанол. Повторите промывку этанолом не менее четырех раз. После промывки нанопроводов переложите их в пятимиллилитровую стеклянную трубку с помощью одномиллилитровой пипетки.
Добавьте 100 микролитров APTES в раствор нанопроволоки и закрутите стеклянную трубку в течение 20 секунд. Поместите трубку в ультразвуковую ванну и обработайте ее ультразвуком в течение одного часа. Затем выньте трубку из ванны и добавьте 400 микролитров деионизированной воды и 20 микролитров гидроксида натрия одного моляра.
Повторите часовую обработку ультразвуком. Вынув стеклянную трубку из ультразвуковой ванны, поместите ее рядом с магнитом для сбора нанопроводов. Замените надосадочную жидкость одним миллилитром свежего абсолютного этанола и произведите ультразвуковую обработку трубки в течение 10 секунд.
Повторите промывку этанолом и ультразвук дважды. Растворите 0,4 миллиграмма EDC и 1,1 миллиграмм Sulfo-NHS и один миллилитр MES в двухмиллилитровой пробирке. В другую двухмиллилитровую пробирку добавьте 960 микролитров 0,1-молярного PBS и добавьте к нему 30 микролитров антитела против CD44.
Далее добавьте в эту пробирку 10 микролитров ранее приготовленной смеси EDC/Sulfo-NHS. Поместите пробирку с антителами в шейкер и встряхните ее при 10-кратной перегрузке в течение 15 минут при комнатной температуре. Тем временем поместите магнит рядом с трубкой с нанопроволокой, покрытой APTES, на две минуты, выбросьте этанол и замените его PBS.
Обрабатывайте нанопроволоки ультразвуком в течение 10 секунд. После последней промывки PBS соберите нанопроволоки и перенесите раствор активированного антитела в трубку нанопроволоки. Затем обрабатывайте его ультразвуком в течение 10 секунд.
Замените трубку во вращателе на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день соберите нанопроволоки с помощью магнита и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр 2% БСА и инкубируйте пробирку в течение часа при четырех градусах Цельсия, чтобы заблокировать реакцию.
Спектроскопия потерь энергии электронов или карты EELS могут быть использованы для визуализации атомов кремния на поверхности нанопроволоки и подтверждения наличия покрытия APTES. На нанопроволоках без покрытия атомы железа выглядят темно-синими, а смешанные атомы железа и кислорода — светло-голубыми. Соответствующее картирование нанопроволок без покрытия EELS показывает более высокую интенсивность железа по отношению к кислороду в центре, чем на поверхности, что указывает на структуру оксида железа.
Картирование показало, что слой оксида железа состоит из большего количества оксида железа(II, III), чем оксида железа(III). Антигенность прикрепленных антител была подтверждена с помощью иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Анализ BCA был использован для количественной оценки количества антител на нанопроволоках.
Измерение дзета-потенциала было использовано для выяснения функционализации поверхности. Концевая аминная группа на APTES уменьшала отрицательный заряд по сравнению с нанопроволоками без покрытия. Функционализация антител еще больше снижала заряд.
Специфическое клеточное нацеливание на функционализированные антителами нанопроволоки было подтверждено с помощью конфокальной микроскопии. На рисунках A и B представлены изображения в светлопольной микроскопии образца C и D соответственно. Красный цвет соответствует изображению клеточной мембраны, синий представляет ядро, а зеленые кластеры показывают наличие прикрепленных целевых нанопроволок CD44.
Кроме того, анализ жизнеспособности клеток был использован для подтверждения того, что нанопроволоки без покрытия, с покрытием APTES и покрытием из антител являются биосовместимыми. В технологическом покрытии APTES очень важно добавлять деионизированную воду перед раствором гидроксида натрия, чтобы улучшить связь между молекулой APTES и нанопроволокой. Кроме того, в процессе биофункционализации необходимо пару раз промыть нанопроволоку буфером PBS, чтобы усилить ковалентную связь между антителом и нанопроволокой.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол биофункционализации магнитных наноматериалов антителами для обеспечения специфического таргетинга клеток, в частности, с использованием железных нанопроволок для воздействия на раковые клетки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нанотехнологии
- Биоматериалы
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Магнитные наноматериалы имеют потенциал применения для направленной доставки лекарств.
- Биофункционализация повышает специфичность наноматериалов к определенным типам клеток.
- Железные нанопроволоки могут быть модифицированы для улучшения их нацеливающих свойств.
- Понимание взаимодействия между наноматериалами и биологическими системами имеет решающее значение для их применения.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол биофункционализации железных нанопроволок.
- Продемонстрировать эффективность нанопроволок, функционализированных антителами, в таргетировании раковых клеток.
- Оценить биосовместимость модифицированных нанопроволок.
Используемые методы
- Получение железных нанопроволок с помощью химических процессов.
- Покрытие нанопроволок APTES для облегчения прикрепления антител.
- Использование EDC/Sulfo-NHS для активации антител.
- Характеристика нанопроволок с помощью спектроскопии потери энергии электронов и измерений дзета-потенциала.
Основные результаты
- С помощью данного протокола были успешно получены функционализированные антителами железные нанопроволоки.
- Конфокальная микроскопия подтвердила специфическое нацеливание модифицированных нанопроволок на раковые клетки.
- Анализы на биосовместимость показали, что нанопроволоки безопасны для применения на клеточном уровне.
- Функционализация поверхности была подтверждена с помощью различных методов характеризации.
Выводы
- Данный метод биофункционализации позволяет осуществлять адресную доставку терапевтических агентов.
- Протокол может быть адаптирован для различных типов наноматериалов.
- Перспективные области применения могут включать таргетную терапию рака с использованием этих нанопроволок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет производить специфически нацеленные магнитные наноматериалы путем ковалентного присоединения антител, что способствует разработке методов прецизионной терапии и диагностики. Повышая специфичность нацеливания и обеспечивая возможность дистанционного магнитного управления, этот метод способствует снижению механистических рисков в онкологических программах на ранних стадиях. Данный подход повышает прогностическую достоверность вмешательств на основе наноматериалов за счет подтверждения как эффективности нацеливания, так и биосовместимости.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем направленного воздействия на специфические маркеры клеточной поверхности, такие как гиперэкспрессия CD44 в раковых клетках.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков путем подтверждения антигенности прикрепленных антител с помощью иммунопреципитации и вестерн-блоттинга.
- Прогностическая ценность: облегчает сортировку портфеля проектов, демонстрируя специфичность таргетинга и биосовместимость на соответствующих клеточных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем, готовых к последующим этапам анализа, с подтверждением функционализации поверхности методами EELS и измерениями дзета-потенциала.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемого образования ковалентных связей и этапов блокировки с использованием BSA.
- Ценность масштабируемости: Возможность повторного использования платформы для наноматериалов из железа, оксида железа и многосегментных структур, включая нанопроволоки железо-золото.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: демонстрирует преемственность от этапа открытия до доклинической валидации с помощью отслеживания методом конфокальной микроскопии и анализов жизнеспособности клеток.
- Прогресс с учетом рисков: обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований («go/no-go») путем проверки биосовместимости наноматериалов без покрытия, с покрытием APTES и с покрытием антителами.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность в механизмах таргетинга, связывая прикрепление антител со специфическим связыванием с клетками, наблюдаемым при визуализации.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая надежную оценку соединений с помощью количественно определяемых магнитореактивных наноматериалов.
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет обеспечения специфической доставки в CD44-положительные раковые клетки.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные результаты посредством сдвигов дзета-потенциала и подтвержденной методом EELS модификации поверхности.
- Аналитика: предоставляет измеряемые показатели, такие как количество антител с помощью BCA-анализа и клеточный захват с помощью конфокальной микроскопии.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет продемонстрированной биосовместимости и специфического таргетинга в клеточных моделях.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования метода синтеза адресных наноматериалов в рамках нескольких проектов и форматов наноматериалов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность, валидация мишени, снижение неопределенности механизмов взаимодействия наноматериалов с клетками.
- Практическая ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость биофункционализации в различных лабораторных условиях.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок, эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях разработки нанотерапевтических средств.
- Влияние на портфель: Приоритезация и принятие решений о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе валидированных профилей таргетинга и безопасности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с наноматериалами, конъюгацией антител и методами характеризации поверхности.
- Необходим доступ к ультразвуковым ваннам, магнитным стойкам, а также к оборудованию для EELS, измерения дзета-потенциала и вестерн-блот-анализа.
- Необходима стандартизация протоколов промывки, блокировки и инкубации между группами исследователей для обеспечения воспроизводимости партий.
- При применении метода к наноматериалам с различной формой, составом или химией поверхности требуются соответствующие корректировки.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость строгого соблюдения последовательности реагентов (например, деионизированная вода перед гидроксидом натрия) для улучшения связывания APTES.
