Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека
9 июня 2020 г.
Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.
Лазерная микродиссекция позволяет проводить транскриптомный анализ пространственно определенных областей в образцах почечной ткани. Это дает нам уникальную возможность идентифицировать структуры, представляющие интерес, даже после того, как произошли изменения, вызванные болезнью. Основными преимуществами данной методики является ее комплементарность с другими омиксными технологиями, такими как секвенирование РНК одиночных клеток.
Он обеспечивает замечательную экономию тканей и даже позволяет обнаруживать низко экспрессированные транскрипты. После получения образца ткани с помощью криостата, установленного на температуру минус 20 градусов Цельсия, разрежьте образец до толщины 12 микрометров и используйте адаптер для предметного стекла, чтобы зафиксировать образец на специализированном предметном стекле для лазерной микродиссекции. В течение 10 дней после криоссекции смешайте 89,2 микролитра 10% БСА без РНКазы в PBS с четырьмя микролитрами фаллоидина FITC, 1,5 микролитрами DAPI, двумя микролитрами представляющего интерес антитела, непосредственно конъюгированного с Alexa Fluor 546, и 3,3 микролитрами ингибитора РНКазы.
Промойте предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия 100% ацетоном в течение одной минуты и поместите предметное стекло в камеру влажности. Промойте верхнюю часть предметного стекла два раза свежим PBS без РНКазы в течение 30 секунд за промывку, а затем два 30-секундных промывки с 10% BSA в PBS, не содержащей РНКазы. После последней промывки обработайте образец приготовленным раствором антител в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем еще два раза промывка 10%-ной БСА в PBS, не содержащей РНКазы.
После второй промывки высушите предметное стекло на воздухе в течение пяти минут в колпаке для культуры тканей, прежде чем загрузить предметное стекло на режущую платформу для лазерной микродиссекции. Установите на устройство автоклавные микроцентрифужные пробирки для сбора объемом 500 микролитров, подходящие для работы ПЦР, содержащие 50 микролитров экстракционного буфера из набора для выделения РНК. После загрузки определите интересующие области в образце по окрашиванию, морфологии и расположению.
Используйте иммунофлюоресценцию, чтобы очертить не менее 500 000 микрометров квадратных сегментов, представляющих интерес. Затем инициируйте лазерную микродиссекцию для иссечения области с использованием мощности лазера более 40. По завершении процесса лазерной микродиссекции закройте пробирки для сбора микроцентрифуг и энергично переверните пробирки, чтобы убедиться, что содержимое перемещается от крышек к дну пробирок.
После центрифугирования пробирки инкубируют на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут, прежде чем снова центрифугировать пробирки. Затем переложите надосадочную жидкость в новые 500 микролитровые пробирки от минус 80 градусов Цельсия для хранения. Идентификация подсегментов канальцев в почке осуществляется путем окрашивания антителами уникальных маркеров канальцев в дополнение к морфологии клеток и структурным ориентирам.
Флуоресцентное мечение в сочетании с морфологическими особенностями тканей и пространственным расположением структур изображения облегчает визуализацию подсегментов почек с высокой степенью достоверности. В этом репрезентативном анализе нисходящего секвенирования вероятность успешного выполнения минимальной входной площади рассечения составила более 90%, что привело к высокому общему количеству мРНК, доступному для обнаружения генов. В этом анализе 100% образцов соответствовали минимальному порогу обнаружения, составляющему не менее 10 000 генов.
После лазерной микродиссекции анализ обогащения экспрессии генов известных маркеров может быть сравнен с таковыми из других компартментов. В этом анализе один маркер для каждого подсегмента был идентифицирован с помощью региональной транскриптомики лазерной микродиссекции, что также дало специфическое иммуногистохимическое окрашивание соответствующего подсегмента нефрона. Важно отметить, что лазерная микродиссекция в значительной степени полагается на опыт пользователя для точного определения структур, представляющих интерес для препарирования.
Этот метод позволяет изучать специфические региональные сигнатуры экспрессии генов, которые могут быть использованы для оценки потенциальных путей, участвующих в прогрессировании заболевания, а также биологии здоровых тканей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол лазерной микродиссекции специфических субсегментов ткани почки человека, включая клубочек и проксимальный каналец. Изолированная РНК из этих компартментов позволяет провести транскриптомный анализ для выявления изменений в паттернах экспрессии генов, связанных с различными структурами почек.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Транскриптомный анализ
- Биология почек
- Исследование прогрессирования заболевания
Теоретические основы
- Значимость изучения субсегментов почек
- Трудности анализа пространственно определенных структур после развития заболевания
- Дополняемость с другими омиксными технологиями
Используемые методы
- Лазерная микродиссекция
- Образцы тканей почки человека
- Выделение и секвенирование РНК
Основные результаты
- Высокая эффективность препарирования и выделения РНК
- Идентификация маркеров экспрессии генов для субсегментов почек
- Продемонстрированы потенциальные пути, связанные с прогрессированием заболевания
Выводы
- В данном протоколе представлен эффективный метод изучения региональной экспрессии генов в почках.
- Полученные результаты способствуют пониманию биологии почек и потенциальных механизмов развития заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Лазерная микродиссекция обеспечивает пространственно-разрешенное транскриптомное профилирование тканей почки человека, восполняя критический пробел в поисковой биологии, при котором методы на основе диссоциации приводят к потере анатомического контекста. Данный подход способствует валидации мишеней путем связывания сигнатур экспрессии генов с определенными субсегментами нефрона, что улучшает механистическую оценку рисков в моделях заболеваний почек. Этот метод обеспечивает прогностическую уверенность при исследовании путей передачи сигнала и приоритизации портфеля в рабочих процессах раннего поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем сопоставления экспрессии генов с анатомически определенными компартментами почек.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет использования пространственно закрепленных транскриптомных сигнатур, сохраняющих тканевый контекст.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем корреляции экспрессии региональных маркеров с функциональной идентичностью субсегментов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: подготовка валидированных биологических систем для последующих омиксных исследований путем выделения высококачественной РНК из микродиссекированных областей.
- Операционная ценность: обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа с помощью параметров контроля качества, позволяющих оценить адекватность образца и эффективность диссекции.
- Масштабируемость: возможность надежной оценки соединений за счет получения количественных пространственно-разрешенных транскриптомных данных для скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает результаты фундаментальных исследований с доклинической валидацией посредством моделирования систем, релевантных конкретным заболеваниям, с использованием субсегментов почек человека.
- Согласованность биомаркеров: способствует разработке трансляционных биомаркеров путем идентификации профилей экспрессии генов, специфичных для конкретных компартментов и определяемых в тканях.
- Продвижение с учетом рисков: обеспечивает информационную поддержку при принятии доклинических решений, выявляя активность сигнальных путей в анатомически точных областях, пораженных заболеванием.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Лазерная микродиссекция является частью континуума открытий — от проверки гипотез до идентификации перспективных мишеней, обеспечивая молекулярное профилирование с пространственным разрешением, которое связывает методы визуализации и омиксные технологии.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем установления связи между экспрессией генов и структурными ориентирами в тканях почек.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря высокому проценту успешного препарирования (>90%) и достаточному выходу РНК для приложений по секвенированию.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных (пороги детекции генов ≥10 000 генов), что позволяет проводить сравнение между различными условиями.
- Трансляционные исследования: повышает преемственность доклинических исследований за счет сохранения пространственного контекста, который теряется при использовании методов на основе диссоциации.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как воспроизводимая технология для различных типов тканей путем замены маркеров антител, что способствует внедрению метода на уровне всей платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет снижения механистической неопределенности при валидации почечных мишеней.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря определенным параметрам рабочего процесса и контрольным точкам качества.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет приоритизации с учетом рисков на основе биологии конкретных подсегментов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает эффективность использования капитала за счет раннего снижения рисков почечных мишеней с использованием пространственно-разрешенных данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении иммунофлуоресцентного окрашивания и морфологической идентификации субсегментов почек.
- Необходимость использования платформ для лазерной микродиссекции и наборов для выделения РНК, совместимых с образцами с низким содержанием материала.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов окрашивания, порогов диссекции и показателей контроля качества.
- Адаптация метода для различных моделей требует валидации маркеров антител и структурных ориентиров в целевых тканях.
- Практические ограничения включают зависимость точности идентификации областей от оператора и необходимость поддержания целостности РНК в процессе обработки.
