Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека

Лазерная микродиссекция позволяет проводить транскриптомный анализ пространственно определенных областей в образцах почечной ткани. Это дает нам уникальную возможность идентифицировать структуры, представляющие интерес, даже после того, как произошли изменения, вызванные болезнью. Основными преимуществами данной методики является ее комплементарность с другими омиксными технологиями, такими как секвенирование РНК одиночных клеток.

Он обеспечивает замечательную экономию тканей и даже позволяет обнаруживать низко экспрессированные транскрипты. После получения образца ткани с помощью криостата, установленного на температуру минус 20 градусов Цельсия, разрежьте образец до толщины 12 микрометров и используйте адаптер для предметного стекла, чтобы зафиксировать образец на специализированном предметном стекле для лазерной микродиссекции. В течение 10 дней после криоссекции смешайте 89,2 микролитра 10% БСА без РНКазы в PBS с четырьмя микролитрами фаллоидина FITC, 1,5 микролитрами DAPI, двумя микролитрами представляющего интерес антитела, непосредственно конъюгированного с Alexa Fluor 546, и 3,3 микролитрами ингибитора РНКазы.

Промойте предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия 100% ацетоном в течение одной минуты и поместите предметное стекло в камеру влажности. Промойте верхнюю часть предметного стекла два раза свежим PBS без РНКазы в течение 30 секунд за промывку, а затем два 30-секундных промывки с 10% BSA в PBS, не содержащей РНКазы. После последней промывки обработайте образец приготовленным раствором антител в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем еще два раза промывка 10%-ной БСА в PBS, не содержащей РНКазы.

После второй промывки высушите предметное стекло на воздухе в течение пяти минут в колпаке для культуры тканей, прежде чем загрузить предметное стекло на режущую платформу для лазерной микродиссекции. Установите на устройство автоклавные микроцентрифужные пробирки для сбора объемом 500 микролитров, подходящие для работы ПЦР, содержащие 50 микролитров экстракционного буфера из набора для выделения РНК. После загрузки определите интересующие области в образце по окрашиванию, морфологии и расположению.

Используйте иммунофлюоресценцию, чтобы очертить не менее 500 000 микрометров квадратных сегментов, представляющих интерес. Затем инициируйте лазерную микродиссекцию для иссечения области с использованием мощности лазера более 40. По завершении процесса лазерной микродиссекции закройте пробирки для сбора микроцентрифуг и энергично переверните пробирки, чтобы убедиться, что содержимое перемещается от крышек к дну пробирок.

После центрифугирования пробирки инкубируют на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут, прежде чем снова центрифугировать пробирки. Затем переложите надосадочную жидкость в новые 500 микролитровые пробирки от минус 80 градусов Цельсия для хранения. Идентификация подсегментов канальцев в почке осуществляется путем окрашивания антителами уникальных маркеров канальцев в дополнение к морфологии клеток и структурным ориентирам.

Флуоресцентное мечение в сочетании с морфологическими особенностями тканей и пространственным расположением структур изображения облегчает визуализацию подсегментов почек с высокой степенью достоверности. В этом репрезентативном анализе нисходящего секвенирования вероятность успешного выполнения минимальной входной площади рассечения составила более 90%, что привело к высокому общему количеству мРНК, доступному для обнаружения генов. В этом анализе 100% образцов соответствовали минимальному порогу обнаружения, составляющему не менее 10 000 генов.

После лазерной микродиссекции анализ обогащения экспрессии генов известных маркеров может быть сравнен с таковыми из других компартментов. В этом анализе один маркер для каждого подсегмента был идентифицирован с помощью региональной транскриптомики лазерной микродиссекции, что также дало специфическое иммуногистохимическое окрашивание соответствующего подсегмента нефрона. Важно отметить, что лазерная микродиссекция в значительной степени полагается на опыт пользователя для точного определения структур, представляющих интерес для препарирования.

Этот метод позволяет изучать специфические региональные сигнатуры экспрессии генов, которые могут быть использованы для оценки потенциальных путей, участвующих в прогрессировании заболевания, а также биологии здоровых тканей.