Доставка антител в мозг с помощью сфокусированного сканирующего ультразвука
18 июля 2020 г.
Здесь представлен протокол для временного открытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) либо фокально, либо по всему мозгу мыши для доставки флуоресцентно меченых антител и активации микроглии. Также представлен метод обнаружения доставки антител и активации микроглии с помощью гистологии.
Только небольшая часть терапевтических антител поглощается мозгом. С помощью нашего метода антитела доставляются в мозг путем временного открытия гематоэнцефалического барьера. Этот метод позволяет нам доставлять антитела в мозг мыши неинвазивным способом.
Чтобы выполнить контроль качества микропузырьков с помощью счетчика клеток, извлеките раствор микропузырьков из амальгаматора и с помощью иглы 19 калибра проколите перегородку флакона с микропузырьковым раствором. Используйте одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 19 калибра, чтобы развести 100 микролитров микропузырьков в пяти миллилитрах отфильтрованного проточного раствора и пипетку 100 микролитров разбавленного раствора микропузырьков в 10 миллилитрах отфильтрованного проточного раствора в кювете. Зафиксируйте кювету на месте на платформе счетчика клеток и убедитесь, что для взятия образца будет использоваться апертура 30 микрон.
В программном обеспечении загрузите стандартный метод работы и выберите «Редактировать стандартный метод работы» и «Концентрация». Введите 5 000 раз для разбавления и нажмите «Применить» и «OK». Нажмите «Редактировать информацию», чтобы выбрать подходящее имя файла. Выберите предварительный просмотр и убедитесь, что концентрация микропузырькового образца составляет менее 10 %Выберите «Начать» и «OK», чтобы начать отбор образца.
После измерения промойте отверстие счетчика ячеек отфильтрованным проточным раствором. Обработайте кювету разведенным микропузырьковым раствором в течение 30 секунд на водяной бане. Измерьте раствор микропузырьков, обработанный ультразвуком, как показано на рисунке, и нажмите кнопку «Редактировать информацию», чтобы пометить данные как пустые.
После измерения заготовки вычтите итоговые показания из исходных, чтобы исключить любые частицы, которые не являются микропузырьками. Чтобы пометить срезы флуоресцентными антителами IgG к мышам, пометьте один миллиграмм антитела IgG мыши препаратом Alexa Flour 647 в 0,1 молярном буфере бикарбоната натрия в соответствии с инструкциями производителя в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации загрузите флуоресцентно меченный раствор антитела в спиновую колонку и очистите антитело центрифугированием.
Затем с помощью спектрофотометра измерьте концентрацию белка. Чтобы настроить сфокусированную сканирующую ультразвуковую систему, добавьте пятимиллиметровое пространство к водяному болюсу, чтобы расположить ультразвуковой фокус на девять миллиметров ниже дна водяного болюса. Заполните водяной ком примерно 300 миллилитрами дегазированной деионизированной воды и поместите кольцевую решетку в заполненный водяной болюс.
С помощью стоматологического зеркала убедитесь, что на поверхности нет пузырьков воздуха, и запустите прикладное программное обеспечение. В меню осциллограммы выберите параметр Задать коэффициент заполнения формы сигнала и установите частоту повторения импульсов на 10 Гц, коэффициент заполнения на 10%, фокус на 80 мм, центральную частоту на один мегагерц, амплитуду на 0,65 мегапаскаля, а механический индекс на 0,65. Нажмите Set, чтобы определить форму сигнала и сохранить его в памяти.
После выбора плана лечения откройте вкладку «Сканирование» в окне контроллера движений и введите значения начала, остановки и приращения для движения в размере X и значения начала, остановки и приращения для движения в направлении Y. Чтобы определить действия для центров обработки, нажмите кнопку «Событие» и откройте окно редактирования сценария. Выберите список действий, которые будут выполняться в порядке, выбранном на каждом участке лечения, и установите тип движения на растровую сетку.
На вкладке событий выберите добавить действия и переместите синхронный переход запуска триггера ARB wait и stop триггер действий ARB на панель скрипта. Затем нажмите действие ожидания и выберите время ожидания 6 000 миллисекунд. Чтобы подготовить животное к анализу, после подтверждения отсутствия реакции на ущипывание пальца ноги у мыши, находящейся под наркозом, с помощью перманентного маркера разметьте центр головы, затем приклейте полиэтиленовую пленку к днищу небольшой весовой лодки с отсечением дна и заполните весовую лодку ультразвуковым гелем.
Для лечения сфокусированным ультразвуком переверните флакон с микропузырьками и аккуратно загрузите один микролитр раствора на грамм массы тела мыши в инсулиновый шприц 29 калибра. Добавьте в шприц 100 микролитров флуоресцентно меченого антитела, аккуратно переверните и прокатите шприц между большим и указательным пальцами, чтобы смешать антитело и микропузырьки внутри шприца. Осторожно и медленно введите в мышь 150 микролитров раствора микропузырька и антитела и установите таймер на две минуты.
Нанесите офтальмологическую мазь, затем поместите мышь в держатель для головы и зафиксируйте ее носик в держателе. Поместите маленькую весовую лодку, наполненную гелевым ультразвуком, на верхнюю часть головы и опустите водяной комок до тех пор, пока он не сядет на ультразвуковой гель внутри весовой лодки. Затем с помощью джойстика визуально выровняйте фокус датчика в центре головы.
Когда таймер сработает, на вкладке движения программного обеспечения выберите «Сбросить исходную точку» и выберите «Завершить сканирование». Когда лечение будет завершено, нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного и поместите мышь в подогретую камеру восстановления. Здесь приводятся репрезентативные результаты измерений размера и концентрации микропузырьков, которые могут быть получены при правильном производстве микропузырьков.
Поглощение антител мозгом может быть легко визуализировано во всех срезах мозга или тканей с помощью инфракрасного сканера или флуоресцентной микроскопии срезов. Как показано на этих изображениях, репрезентативное окрашивание маркеров микроглии может быть использовано для определения того, становится ли микроглия более фагоцитарной после доставки антитела. Важно обеспечить благополучие и безопасность животных, особенно при выполнении ретроорбитальных инъекций и применении датчика над головами мышей.
Этот метод позволяет применять различные шаблоны сканирования для нацеливания на различные области мозга, такие как гиппокамп, кора или отдельные полушария мозга. Этот метод может быть использован для разработки новых методов лечения и лекарств, которые проникают через гематоэнцефалический барьер, а также для изучения механизма формирования и открытия гематоэнцефалического барьера.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод временного открытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на моделях мышей для облегчения доставки флуоресцентно-меченных антител и активации микроглии. Данный метод обеспечивает неинвазивную доставку и позволяет проводить мониторинг поглощения антител в головном мозге с помощью гистологических методов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Терапевтическая доставка
Теоретические основы
- Гематоэнцефалический барьер ограничивает проникновение терапевтических антител в мозг.
- Микроглия играет критическую роль в иммунных ответах головного мозга.
- Современные методики открытия ГЭБ и доставки антител ограничены.
- Флуоресцентное мечение способствует визуализации поглощения антител и активации микроглии.
Цель исследования
- Разработать протокол временного открытия ГЭБ для доставки антител.
- Активировать микроглию в контролируемых экспериментальных условиях.
- Оценить эффективность данного метода доставки с помощью гистологического анализа.
Используемые методы
- Методика включает применение сфокусированного ультразвука и введение микропузырьков в мозг мыши.
- В качестве основной биологической модели используются анестезированные мыши.
- Основные этапы включают подготовку микропузырьков и антител, а также точное ультразвуковое нацеливание.
- Флуоресцентные антитела подвергают очистке и визуализации для измерения взаимодействия с микроглиальными клетками.
Основные результаты
- Метод успешно продемонстрировал доставку антител в мозг.
- Микроглия проявила повышенную фагоцитарную активность после введения антител.
- Методы визуализации подтвердили эффективную локализацию и поглощение антител.
- Схемы сканирования позволили воздействовать на конкретные области мозга, расширяя возможности терапевтического применения.
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод улучшения доставки терапевтических антител через гематоэнцефалический барьер.
- Оно открывает возможности для дальнейших исследований в области разработки лекарственных препаратов и изучения механизмов работы мозга.
- Полученные результаты подчеркивают потенциал этого метода для изучения нейроиммунологических взаимодействий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Фокусированный сканирующий ультразвук (SUS) с использованием микропузырьков обеспечивает временное открытие гематоэнцефалического барьера для усиления доставки антител в мозг, что позволяет преодолеть ключевое ограничение в терапии нейродегенеративных заболеваний. Этот неинвазивный подход улучшает взаимодействие с мишенью и способствует снижению механистических рисков, позволяя проводить количественную оценку биораспределения и клеточного захвата антител. Данный метод обеспечивает прогностическую уверенность на ранних этапах разработки за счет подтверждения способности кандидатов в антитела проникать в мозг до перехода к дорогостоящим доклиническим исследованиям.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать доступ терапевтических антител к мишеням в головном мозге, что способствует валидации мишеней в моделях нейродегенеративных заболеваний.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый метод оценки биораспределения антител и взаимодействия с мишенью in vivo.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: облегчает подготовку тканей мозга после доставки антител для последующих гистологических анализов и методов визуализации.
- Практическая ценность: стандартизирует параметры доставки для обеспечения согласованного воздействия антител во всех экспериментальных группах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает доставку антител, имеющих значение для конкретного заболевания, для оценки модуляции мишени и активации сигнального пути в доклинических моделях.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять regionally-специфическую доставку (например, в гиппокамп, кору), что соответствует патологии заболевания и задачам исследований биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод встраивается в континуум разработки, обеспечивая раннюю валидацию проникновения антител в мозг, что позволяет обосновать решения по идентификации ведущих соединений и поддерживает преклиническую преемственность за счет анализа доставки в конкретные области и показателей активности микроглии.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о доступе антител к мишеням в мозге и уточнение путей передачи сигналов за счет улучшенной доставки.
- Скрининг: обеспечивает стабильную доставку антител в ткани мозга, позволяя проводить надежную оценку соединений или мишеней in vivo.
- Аналитика: обеспечивает количественное определение концентрации антител в мозге и оценку фагоцитоза микроглии в качестве функционального биомаркера взаимодействия.
- Трансляционные исследования: связывает эффективность доставки с доклинической валидацией, обеспечивая доступ антител к релевантным при заболевании областям мозга.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для оценки проницаемости ГЭБ различных форматов антител в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования проникновения антител в мозг, снижая неопределенность механизмов при валидации мишени.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированную и воспроизводимую экспозицию антител в различных исследованиях за счет контролируемых параметров ультразвука и микропузырьков.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние данные о проникновении в мозг, что снижает риск неудач на поздних стадиях из-за низкой проницаемости через ГЭБ.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов из антител с учетом рисков на основе подтвержденной эффективности доставки в мозг.
Особенности реализации
- Для точной настройки и проведения процедуры требуются экспертные знания в области физики ультразвука, работы с микропузырьками и прижизненной визуализации (in vivo).
- Оборудование включает фокусирующий ультразвуковой преобразователь, водяной болюс, систему подготовки микропузырьков и средства флуоресцентной детекции.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межгрупповая стандартизация параметров ультразвука (частоты, амплитуды, рабочего цикла) и протоколов инъекций.
- Адаптация метода для различных моделей требует корректировки схем сканирования и нацеливания ультразвука в соответствии с анатомией мозга и областями, значимыми для конкретного заболевания.
- Практические ограничения включают вариабельность эффективности открытия ГЭБ, а также необходимость тщательного мониторинга состояния животных во время ретроорбитального введения и применения преобразователя.
