Методы микроинъекции эмбрионов для эффективного сайт-специфического мутагенеза при Culex quinquefasciatus

Методы микроинъекций эмбрионов проложили путь к разработке многочисленных генетических инструментов контроля векторов. Несмотря на то, что у многих видов насекомых уже хорошо разработаны протоколы, Culex quinquefasciatus остается относительно малоизученным. Этот протокол микроинъекций был специально разработан с учетом уникальных биологических особенностей Culex quinquefasciatus, включая сбор яйцеклеток, разделение яйцеклеток и процедуры после инъекции.

Этот метод, вероятно, может быть адаптирован к любому интересующему виду Culex и может быть использован для изучения функции генов или для создания генетически обоснованных технологий контроля для видов Culex. Начните с отделения яиц от плотов. С помощью щипцов или кисти надавите на плот и раздразните отдельные яйца.

Выровняйте яйца на тонкой полоске двустороннего скотча, помещенной поперек верхней части предметного стекла, стараясь направить переднюю сторону каждого яйца в одном направлении. Приготовьте галоидоуглеродную смесь, аккуратно смешав галоидоуглеродные реагенты с водой, и инкубируйте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи. Накройте выровненные яйца смесью галоидоуглеродного масла.

Чтобы создать иглы для микроинъекций, поместите алюмосиликатное капиллярное стекло в съемник игл, следуя инструкциям производителя. Установите нагрев на 560, скорость на 100, задержку на 70, тягу на 97 и давление на 500. Затем активируйте съемник игл.

Осторожно коснитесь кончика вытянутой иглы на вращающейся алмазной абразивной пластине в течение примерно 10 секунд под углом 50 градусов, чтобы скос кончика иглы. Встраиваем вытянутые и скошенные спицы в линии пластилина лепки в чашку Петри. Приготовьте инъекционную смесь, состоящую из реагентов для модификации генома, и храните ее на льду.

С помощью наконечника микрозагрузчика загрузите два микролитра инъекционной смеси в иглу для инъекций. Поместите заполненную иглу для инъекций в микроманипулятор, подключенный к электронному микроинъектору, и поместите предметное стекло с выровненными яйцами на предметное столико составного микроскопа. С помощью микроманипулятора выровняйте иглу так, чтобы она была направлена на задний конец эмбриона под углом от 25 до 35 градусов.

Осторожно введите иглу в эмбрион и введите смесь в количестве около 10% от объема эмбриона. Введите 20 яйцеклеток за один раз, затем остановитесь и выполните процедуры восстановления эмбрионов. В течение 20 минут после инъекции осторожно удалите галогеноуглеродное масло из яиц, слегка потерев их чистой кистью.

Поднимите яйца с помощью кисти и поместите их в чашку с двойной дистиллированной водой, следя за тем, чтобы яйца оставались на поверхности. В течение следующих семи дней ежедневно проверяйте яйца на вылупление и следуйте обычным процедурам выращивания личинок. Проведите скрининг введенных комаров на наличие мутантных фенотипов с помощью стереоскопа.

Этот метод был использован для успешной генерации соматических и зародышевых мутаций гена, имеющего решающее значение для развития пигментации темных глаз. Соматические мутации, сгенерированные CRISPR-Cas9, были оценены с помощью скрининга на потерю пигментации в глазах стадии зрачка у инъекционных пациентов. Соматические мутации, как правило, присутствовали в виде мозаичных фенотипов, где некоторые, но не все клетки имеют мутантный фенотип.

Частота мутаций зародышевой линии определялась путем скрещивания мозаичных особей с нулевым G-нулем и подсчета баллов для полностью белоглазого потомства. Эти эксперименты привели к выживаемости эмбрионов от 64 до 82%, соматическому мутагенезу от 37 до 57% и коэффициенту мутагенеза зародышевой линии более 61%. За счет мультиплексирования sgРНК для нацеливания на несколько локусов в одном и том же гене, скорость мутагенеза соматической и зародышевой линий увеличилась до 86%.

Чтобы оптимизировать выживаемость и скорость мутагенеза, все материалы, включая галоидоуглеродное масло, жидкость для инъекций и иглы, должны быть должным образом подготовлены перед попыткой микроинъекций. Это позволит сделать процесс микроинъекций более упорядоченным и целенаправленным.