Методы микроинъекции эмбрионов для эффективного сайт-специфического мутагенеза при Culex quinquefasciatus
24 мая 2020 г.
Этот протокол описывает процедуры микроинъекции для эмбрионов Culex quinquefasciatus, которые оптимизированы для работы с инструментами редактирования генов CRISPR / Cas9. Этот метод может эффективно генерировать специфические для сайта, наследственные мутации зародышевой линии, которые могут быть использованы для создания генетических технологий у этого недостаточно изученного переносчика болезней.
Методы микроинъекций эмбрионов проложили путь к разработке многочисленных генетических инструментов контроля векторов. Несмотря на то, что у многих видов насекомых уже хорошо разработаны протоколы, Culex quinquefasciatus остается относительно малоизученным. Этот протокол микроинъекций был специально разработан с учетом уникальных биологических особенностей Culex quinquefasciatus, включая сбор яйцеклеток, разделение яйцеклеток и процедуры после инъекции.
Этот метод, вероятно, может быть адаптирован к любому интересующему виду Culex и может быть использован для изучения функции генов или для создания генетически обоснованных технологий контроля для видов Culex. Начните с отделения яиц от плотов. С помощью щипцов или кисти надавите на плот и раздразните отдельные яйца.
Выровняйте яйца на тонкой полоске двустороннего скотча, помещенной поперек верхней части предметного стекла, стараясь направить переднюю сторону каждого яйца в одном направлении. Приготовьте галоидоуглеродную смесь, аккуратно смешав галоидоуглеродные реагенты с водой, и инкубируйте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи. Накройте выровненные яйца смесью галоидоуглеродного масла.
Чтобы создать иглы для микроинъекций, поместите алюмосиликатное капиллярное стекло в съемник игл, следуя инструкциям производителя. Установите нагрев на 560, скорость на 100, задержку на 70, тягу на 97 и давление на 500. Затем активируйте съемник игл.
Осторожно коснитесь кончика вытянутой иглы на вращающейся алмазной абразивной пластине в течение примерно 10 секунд под углом 50 градусов, чтобы скос кончика иглы. Встраиваем вытянутые и скошенные спицы в линии пластилина лепки в чашку Петри. Приготовьте инъекционную смесь, состоящую из реагентов для модификации генома, и храните ее на льду.
С помощью наконечника микрозагрузчика загрузите два микролитра инъекционной смеси в иглу для инъекций. Поместите заполненную иглу для инъекций в микроманипулятор, подключенный к электронному микроинъектору, и поместите предметное стекло с выровненными яйцами на предметное столико составного микроскопа. С помощью микроманипулятора выровняйте иглу так, чтобы она была направлена на задний конец эмбриона под углом от 25 до 35 градусов.
Осторожно введите иглу в эмбрион и введите смесь в количестве около 10% от объема эмбриона. Введите 20 яйцеклеток за один раз, затем остановитесь и выполните процедуры восстановления эмбрионов. В течение 20 минут после инъекции осторожно удалите галогеноуглеродное масло из яиц, слегка потерев их чистой кистью.
Поднимите яйца с помощью кисти и поместите их в чашку с двойной дистиллированной водой, следя за тем, чтобы яйца оставались на поверхности. В течение следующих семи дней ежедневно проверяйте яйца на вылупление и следуйте обычным процедурам выращивания личинок. Проведите скрининг введенных комаров на наличие мутантных фенотипов с помощью стереоскопа.
Этот метод был использован для успешной генерации соматических и зародышевых мутаций гена, имеющего решающее значение для развития пигментации темных глаз. Соматические мутации, сгенерированные CRISPR-Cas9, были оценены с помощью скрининга на потерю пигментации в глазах стадии зрачка у инъекционных пациентов. Соматические мутации, как правило, присутствовали в виде мозаичных фенотипов, где некоторые, но не все клетки имеют мутантный фенотип.
Частота мутаций зародышевой линии определялась путем скрещивания мозаичных особей с нулевым G-нулем и подсчета баллов для полностью белоглазого потомства. Эти эксперименты привели к выживаемости эмбрионов от 64 до 82%, соматическому мутагенезу от 37 до 57% и коэффициенту мутагенеза зародышевой линии более 61%. За счет мультиплексирования sgРНК для нацеливания на несколько локусов в одном и том же гене, скорость мутагенеза соматической и зародышевой линий увеличилась до 86%.
Чтобы оптимизировать выживаемость и скорость мутагенеза, все материалы, включая галоидоуглеродное масло, жидкость для инъекций и иглы, должны быть должным образом подготовлены перед попыткой микроинъекций. Это позволит сделать процесс микроинъекций более упорядоченным и целенаправленным.
Обзор
В данном протоколе описаны методы микроинъекций в эмбрионы Culex quinquefasciatus, оптимизированные для редактирования генов с помощью системы CRISPR/Cas9. Это позволяет эффективно создавать наследуемые герминальные мутации для генетических исследований и разработки технологий контроля переносчиков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная инженерия
- Биология векторов
- Технология CRISPR/Cas9
Теоретическая база
- Culex quinquefasciatus является недостаточно изученным переносчиком заболеваний.
- Методы микроинъекций имеют решающее значение для разработки инструментов генетического контроля.
- Существующие протоколы для других видов насекомых хорошо отработаны.
- Данный метод учитывает уникальные биологические особенности видов Culex.
Цель исследования
- Разработать протокол микроинъекций для Culex quinquefasciatus.
- Обеспечить возможность изучения функций генов и применения технологий генетического контроля.
- Оптимизировать показатели выживаемости и уровни мутагенеза в инъецированных эмбрионах.
Используемые методы
- Методы сбора икры и отделения плотиков.
- Приготовление галокарбонового масла и инъекционной смеси.
- Микроинъекция эмбрионов с использованием микроманипулятора.
- Скрининг мутантных фенотипов после инъекции.
Основные результаты
- Достигнут уровень выживаемости эмбрионов 64-82%.
- Частота соматического мутагенеза составила 37-57%.
- Частота мутагенеза в зародышевой линии превысила 61%.
- Мультиплексирование sgRNA повысило частоту мутагенеза до 86%.
Выводы
- Данный протокол успешно позволяет индуцировать соматические и герминальные мутации.
- В лаборатории были поддерживались жизнеспособные гомозиготные линии мутантов.
- Надлежащая подготовка материалов оптимизирует процесс микроинъекций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективная микроинъекция эмбрионов позволяет проводить сайт-специфический мутагенез у Culex quinquefasciatus — основного переносчика таких заболеваний, как вирус Западного Нила и лимфатический филяриоз. Эта возможность способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска новых препаратов за счет создания наследуемых мутаций для функционального изучения генов. Данный протокол позволяет преодолеть видоспецифические барьеры, повышая прогностическую достоверность при идентификации мишеней для контроля переносчиков и разработке доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством точного нокаута генов в переносчике заболевания из класса насекомых.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый метод создания герминальных мутаций для функциональной валидации мишеней, участвующих в передаче патогена.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных целей в портфеле исследований путем установления связи между нарушением работы гена и фенотипическими результатами, критическими для компетентности переносчика.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели мутагенеза (частоту соматических и герминальных мутаций) для оценки эффективности редактирования различных вариантов направляющих РНК.
- Практическая ценность: стандартизирует работу с эмбрионами и условия инъекций, что повышает воспроизводимость анализа между разными экспериментальными сериями.
- Масштабируемость: обеспечивает возможность мультиплексной доставки sgRNA для повышения частоты мутагенеза, что способствует высокопроизводительному скринингу мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: получение наследуемых мутантов с белыми глазами для создания стабильных генетических линий для долгосрочных исследований фенотипа и передачи признаков.
- Практическая ценность: достижение выживаемости эмбрионов на уровне 64–82%, что обеспечивает достаточное количество жизнеспособных мутантов для последующего фенотипического скрининга.
- Трансляционная преемственность: поддержание жизнеспособных гомозиготных мутантных линий на протяжении нескольких поколений, что способствует доклинической оценке стратегий генетического контроля.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от гипотезы о мишени до идентификации ведущего соединения — обеспечивая возможность функциональной геномики для малоизученного вида переносчиков.
- Поиск биологических мишеней: Поддерживает проверку гипотез с помощью мутагенеза, опосредованного системой CRISPR/Cas9, для выяснения функции генов во взаимодействиях между патогеном и переносчиком.
- Скрининг: Обеспечивает количественную оценку частоты мутагенеза (37–57% соматических, >61% герминальных) для сравнения эффективности гидовых РНК и оптимизации условий редактирования.
- Аналитика: Позволяет оценивать фенотипы мутантов с помощью стереоскопического скрининга, обеспечивая измеримые результаты для валидации хитов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от открытия гена до разработки доклинических моделей путем создания стабильных линий мутантов.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный рабочий процесс микроинъекций, применимый для различных видов Culex, что сокращает необходимость в повторной разработке протоколов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет обеспечения прямой связи между генотипом и фенотипом в модели трансмиссивного заболевания.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированному выравниванию яиц, использованию галокарбонового слоя и этапам подготовки иглы.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем функциональной валидации мишеней, необходимых для выживания переносчика или передачи патогена.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе частоты наследуемых мутаций и степени выраженности фенотипа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с эмбрионами, навыками микроманипуляции, а также проведения флуоресцентного или стереоскопического скрининга.
- Жизнеспособность эмбрионов зависит от работы вытягивателя игл, микроинъектора и подготовки галоуглеродного масла.
- Необходима межгрупповая стандартизация методов сбора яиц и разделения плотиков.
- Адаптация метода для разных видов Culex может потребовать корректировки объема инъекции и геометрии иглы.
- Практические ограничения включают хрупкость эмбрионов и необходимость немедленного восстановления после инъекции для поддержания уровня выживаемости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
