Методы микроинъекции эмбрионов для эффективного сайт-специфического мутагенеза при Culex quinquefasciatus
24 мая 2020 г.
Этот протокол описывает процедуры микроинъекции для эмбрионов Culex quinquefasciatus, которые оптимизированы для работы с инструментами редактирования генов CRISPR / Cas9. Этот метод может эффективно генерировать специфические для сайта, наследственные мутации зародышевой линии, которые могут быть использованы для создания генетических технологий у этого недостаточно изученного переносчика болезней.
Методы микроинъекций эмбрионов проложили путь к разработке многочисленных генетических инструментов контроля векторов. Несмотря на то, что у многих видов насекомых уже хорошо разработаны протоколы, Culex quinquefasciatus остается относительно малоизученным. Этот протокол микроинъекций был специально разработан с учетом уникальных биологических особенностей Culex quinquefasciatus, включая сбор яйцеклеток, разделение яйцеклеток и процедуры после инъекции.
Этот метод, вероятно, может быть адаптирован к любому интересующему виду Culex и может быть использован для изучения функции генов или для создания генетически обоснованных технологий контроля для видов Culex. Начните с отделения яиц от плотов. С помощью щипцов или кисти надавите на плот и раздразните отдельные яйца.
Выровняйте яйца на тонкой полоске двустороннего скотча, помещенной поперек верхней части предметного стекла, стараясь направить переднюю сторону каждого яйца в одном направлении. Приготовьте галоидоуглеродную смесь, аккуратно смешав галоидоуглеродные реагенты с водой, и инкубируйте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи. Накройте выровненные яйца смесью галоидоуглеродного масла.
Чтобы создать иглы для микроинъекций, поместите алюмосиликатное капиллярное стекло в съемник игл, следуя инструкциям производителя. Установите нагрев на 560, скорость на 100, задержку на 70, тягу на 97 и давление на 500. Затем активируйте съемник игл.
Осторожно коснитесь кончика вытянутой иглы на вращающейся алмазной абразивной пластине в течение примерно 10 секунд под углом 50 градусов, чтобы скос кончика иглы. Встраиваем вытянутые и скошенные спицы в линии пластилина лепки в чашку Петри. Приготовьте инъекционную смесь, состоящую из реагентов для модификации генома, и храните ее на льду.
С помощью наконечника микрозагрузчика загрузите два микролитра инъекционной смеси в иглу для инъекций. Поместите заполненную иглу для инъекций в микроманипулятор, подключенный к электронному микроинъектору, и поместите предметное стекло с выровненными яйцами на предметное столико составного микроскопа. С помощью микроманипулятора выровняйте иглу так, чтобы она была направлена на задний конец эмбриона под углом от 25 до 35 градусов.
Осторожно введите иглу в эмбрион и введите смесь в количестве около 10% от объема эмбриона. Введите 20 яйцеклеток за один раз, затем остановитесь и выполните процедуры восстановления эмбрионов. В течение 20 минут после инъекции осторожно удалите галогеноуглеродное масло из яиц, слегка потерев их чистой кистью.
Поднимите яйца с помощью кисти и поместите их в чашку с двойной дистиллированной водой, следя за тем, чтобы яйца оставались на поверхности. В течение следующих семи дней ежедневно проверяйте яйца на вылупление и следуйте обычным процедурам выращивания личинок. Проведите скрининг введенных комаров на наличие мутантных фенотипов с помощью стереоскопа.
Этот метод был использован для успешной генерации соматических и зародышевых мутаций гена, имеющего решающее значение для развития пигментации темных глаз. Соматические мутации, сгенерированные CRISPR-Cas9, были оценены с помощью скрининга на потерю пигментации в глазах стадии зрачка у инъекционных пациентов. Соматические мутации, как правило, присутствовали в виде мозаичных фенотипов, где некоторые, но не все клетки имеют мутантный фенотип.
Частота мутаций зародышевой линии определялась путем скрещивания мозаичных особей с нулевым G-нулем и подсчета баллов для полностью белоглазого потомства. Эти эксперименты привели к выживаемости эмбрионов от 64 до 82%, соматическому мутагенезу от 37 до 57% и коэффициенту мутагенеза зародышевой линии более 61%. За счет мультиплексирования sgРНК для нацеливания на несколько локусов в одном и том же гене, скорость мутагенеза соматической и зародышевой линий увеличилась до 86%.
Чтобы оптимизировать выживаемость и скорость мутагенеза, все материалы, включая галоидоуглеродное масло, жидкость для инъекций и иглы, должны быть должным образом подготовлены перед попыткой микроинъекций. Это позволит сделать процесс микроинъекций более упорядоченным и целенаправленным.
Обзор
В данном протоколе описаны методы микроинъекций эмбрионов Culex quinquefasciatus, оптимизированные для редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Этот метод позволяет эффективно создавать наследуемые мутации в зародышевой линии для генетических исследований и разработки технологий контроля переносчиков заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная инженерия
- Биология векторов
- Технология CRISPR/Cas9
Теоретические основы
- Culex quinquefasciatus является недостаточно изученным переносчиком заболеваний.
- Методы микроинъекций имеют решающее значение для разработки инструментов генетического контроля.
- Существующие протоколы для других видов насекомых хорошо зарекомендовали себя.
- Данный метод учитывает уникальные биологические особенности видов Culex.
Цель исследования
- Разработать протокол микроинъекций для *Culex quinquefasciatus*.
- Обеспечить возможность изучения функций генов и применения технологий генетического контроля.
- Оптимизировать показатели выживаемости и эффективность мутагенеза в инъектированных эмбрионах.
Используемые методы
- Методы сбора икры и отделения пласта.
- Приготовление галокарбонового масла и смеси для инъекций.
- Микроинъекция эмбрионов с использованием микроманипулятора.
- Скрининг мутантных фенотипов после инъекции.
Основные результаты
- Достигнут уровень выживаемости эмбрионов 64–82%.
- Частота соматического мутагенеза варьировалась от 37% до 57%.
- Частота мутагенеза в зародышевой линии превысила 61%.
- Мультиплексирование sgRNAs позволило увеличить частоту мутагенеза до 86%.
Выводы
- Данный протокол позволяет успешно индуцировать соматические и герминативные мутации.
- В лаборатории были поддерживались жизнеспособные гомозиготные линии мутантов.
- Надлежащая подготовка материалов оптимизирует процесс микроинъекций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективная микроинъекция эмбрионов позволяет осуществлять сайт-специфический мутагенез у Culex quinquefasciatus — ключевого переносчика таких заболеваний, как вирус Западного Нила и лимфатический филяриоз. Эта возможность поддерживает валидацию мишеней и механистическое снижение рисков на ранних этапах поиска путем создания наследуемых мутаций для функциональных исследований генов. Данный протокол решает проблему видоспецифических барьеров, повышая прогностическую достоверность идентификации мишеней для контроля переносчиков и разработки доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем точного нокаута генов в переносчике заболевания из числа насекомых.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый метод создания герминальных мутаций для функциональной валидации мишеней, участвующих в передаче патогенов.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля исследований путем установления связи между нарушением функции гена и фенотипическими результатами, имеющими критическое значение для компетентности переносчика.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели мутагенеза (частоту соматических и герминативных мутаций) для оценки эффективности редактирования при различных вариантах дизайна гидовой РНК.
- Практическая ценность: стандартизирует правила работы с эмбрионами и условия инъекций, что повышает воспроизводимость анализа в разных сериях экспериментов.
- Масштабируемость: обеспечивает возможность мультиплексной доставки sgRNA для повышения частоты мутагенеза, что поддерживает высокопроизводительный скрининг мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет получать наследуемые мутации белого глаза для создания стабильных генетических линий для долгосрочных фенотипических исследований и изучения механизмов передачи признаков.
- Практическая ценность: Обеспечивает выживаемость эмбрионов на уровне 64–82%, что гарантирует наличие достаточного количества жизнеспособных мутантов для последующего фенотипического скрининга.
- Трансляционная преемственность: Позволяет поддерживать жизнеспособные гомозиготные мутантные штаммы на протяжении нескольких поколений, что способствует доклинической оценке стратегий генетического контроля.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от гипотезы о мишени до идентификации ведущего соединения — обеспечивая возможность проведения функциональной геномики на малоизученном виде переносчика.
- Открытия в биологии: поддерживает проверку гипотез с помощью мутагенеза на основе системы CRISPR/Cas9 для выяснения функций генов во взаимодействиях между патогеном и переносчиком.
- Скрининг: обеспечивает количественную оценку частоты мутаций (37–57% соматических, >61% герминальных) для сравнения эффективности направляющих РНК и оптимизации условий редактирования.
- Аналитика: позволяет оценивать мутантные фенотипы с помощью стереоскопического скрининга, предоставляя измеримые данные для валидации выявленных мишеней.
- Трансляционные исследования: способствует преемственности от открытия генов до разработки доклинических моделей путем создания стабильных мутантных линий.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс микроинъекций, применимый для различных видов Culex, что сокращает необходимость в повторной разработке протоколов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая прямую связь между генотипом и фенотипом в модели трансмиссивного заболевания.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированного выравнивания яиц, наложения галокарбонового слоя и этапов подготовки иглы.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go), обеспечивая функциональную валидацию мишеней, необходимых для выживания переносчика или передачи патогена.
- Влияние на портфель разработок: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с поправкой на риск на основе частоты наследуемых мутаций и тяжести фенотипа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с эмбрионами, навыки микроманипуляций, а также проведения флуоресцентного или стереоскопического скрининга.
- Жизнеспособность эмбрионов зависит от использования вытягивателя капилляров, микроинъектора и подготовки галокарбонового масла.
- Необходима стандартизация методов сбора яиц и разделения плотиков между всеми группами исследователей.
- Адаптация метода для различных видов Culex может потребовать корректировки объема инъекции и геометрии иглы.
- Практические ограничения включают хрупкость эмбрионов и необходимость немедленного восстановления после инъекции для поддержания уровня выживаемости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
