Метод количественного определения микроРНК в почке мышиной модели с ишемическим повреждением почек

Измененная экспрессия микроРНК в ОПП может быть полезна для биомаркеров и терапии. Этот протокол прост и позволяет получать постоянные результаты между лабораториями. ИРИ почек представляет собой один из основных факторов риска развития ОПП. Количественная оценка микроРНК, которые изменяются под действием IRI, приводит к постановке диагноза. МикроРНК, выделенные из образца почки, помещаются в другую систему. Внимательно следите за гипотермией, увлажнением кишечника и глубиной анестезии на протяжении всей процедуры. Это связано с тем, что существует множество ручных техник, к которым нужно привыкнуть.

[Рассказчик] После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальца ноги поместите мышь под наркозом на нагретую хирургическую подушечку в положении лежа на спине. После того, как вы сделаете разрез по средней линии живота, используйте ватный тампон, смоченный PBS, чтобы аккуратно протолкнуть кишечник к левой стороне дополнительной брюшной полости, чтобы обнажить правую почку и мочеточник, и используйте угловые щипцы для поднятия правого мочеточника. Перевязать мочеточник в двух местах шелковыми плетеными нитями 4-0, оставив более длинные завязки для шва, который находится ближе к почке, и надрезать между швами. Осторожно придерживая оставшийся шов, тупо рассеките соединительную ткань и жир вдоль почки и определите кровеносный сосуд, который не является почечными артериями или венами, снабжающими кровью нужную почку. Перевязать сосуд и, когда правая почка будет достаточно отделена, перевязать почечную вену и артерию. С помощью ватного тампона, смоченного в PBS, осторожно протолкните кишечник к правой стороне дополнительной брюшной полости, чтобы обнажить левую почку, и накройте кишечник увлажненной простыней. После подготовки левой почки, как показано на рисунке, зажмите почечную артерию и вену на расстоянии одного сантиметра от почки, чтобы вызвать ишемию левой почки. Успешная ишемия может быть визуально подтверждена постепенным равномерным потемнением почечной ткани. Когда ишемия подтвердится, верните кишечную ткань в брюшную полость, стараясь избежать перекручивания кишечника, и временно закройте и задрапируйте кожу живота. Через 25-45 минут снимите зажим и убедитесь, что кровоток, реперфузия и цвет почек улучшились. Убедившись, что кишечник не перекручен, закапывают внутрибрюшинную PBS и закрывают мышцы живота и кожу в два слоя с помощью нейлоновых швов 4-0. Через 24 часа после индукции ишемической травмы вновь откройте разрез по средней линии и с помощью иглы 27-го калибра отоберите кровь из нижней полой вены. Сделайте разрез по средней линии в грудной стенке и введите иглу 23-го калибра в левый желудочек. После подтверждения обратного потока в иглу сделайте разрез в правой доле печени и введите 20 миллилитров PBS. Печень изменится на красный на розовый, подтверждая, что было откачано достаточное количество крови. С помощью щипцов и ножниц удалите левую почку и промойте иссеченную ткань в посуде PBS. Затем с помощью щипцов удалите почечную фасцию без пересыхания почки и разрежьте почку пополам по вертикальной средней линии. Для очистки микроРНК поместите 30 миллиграммов замороженного образца почки в стеклянный гомогенизатор, содержащий 700 микролитров реагента для лизиса на основе фенилгуанидина, на лед и медленно и многократно поворачивайте пестик для полной гомогенизации образца. Когда ткань будет полностью диссоциирована, перенесите гомогенизированный лизат в систему измельчения биополимеров в микроцентрифужной спин-колонне в двухмиллилитровой пробирке и соберите образец на дно пробирки путем центрифугирования. Переложите лизат в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 140 микролитров хлороформа, и перемешайте пробирку путем инверсии в течение 15 секунд с надежно затянутой крышкой. После двух-трехминутной инкубации при комнатной температуре отсадите образец методом центрифугирования и перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую в 1,5 раза больше 100% этанола, не нарушая гранулы. Перемешивайте образец в течение пяти секунд путем вортексирования, прежде чем перенести 700 микролитров образца в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны в двухмиллилитровой пробирке для сбора. После краткого центрифугирования отбросьте проточный поток и промойте образец два раза 500 микролитрами буфера для промывки 2 в новой спиновой колонке на основе кремнеземной мембраны на каждую промывку, чтобы удалить любые следы соли. После второй промывки снова центрифугируйте спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны и, отбросив проточный, перенесите колонку в новую сборную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в колонку 25 микролитров воды, не содержащей РНКазы, и инкубируйте образец в течение пяти минут при комнатной температуре, прежде чем снова центрифугировать образец. Затем перенесите 25-микролитровый элюит, содержащий микроРНК, в новую микроцентрифужную пробирку. В этом исследовании были изучены семь микроРНК, экспрессируемых у людей, которые активировались в почках мышей с острым повреждением почек. Было обнаружено, что уровни шести микроРНК значительно повышены в почках мышей с ишемическим реперфузионным повреждением по сравнению с таковыми у мышей, использующих количественную ПЦР в реальном времени, как это было продемонстрировано. Уровни мочевины в сыворотке крови, азота и креатинина, а также острый канальцевый некроз также были значительно повышены.

Биомаркеры для диагностики ИРИ и специфического лечения ОПП остаются неясными. Я надеюсь, что исследования микроРНК будут продвигаться вперед и внесут вклад в диагностику и лечение ОПП.