Количественная оценка ПЦР в реальном времени микроРНК выражений в мышеловой почки с односторонним мочеборным препятствием

Этот метод позволяет обеспечить экспрессию микроРНК в почках мышей с широким спектром патологических состояний, таких как почечный фиброз. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет микроРНК экспрессии профилирования с высокой точностью и чувствительностью с помощью простого процесса, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Для выполнения фиктивной операции используйте хирургические ножницы и пинцет, чтобы сделать разрез в коже живота и сократить мышцы и брюшной мембраны от мочевого пузыря до левого нижнего края ребер.

Смочите два ватных тампона с PBS и осторожно потяните кишечник в сторону. Поместите увлажненые тампоны для идентификации левой почки и мочеточника. Закройте перитонеальную мембрану, а затем разрез с 4-0 нейлона.

Для выполнения односторонней уретальной обструкции, или UUO, сделать разрез в коже на животе и сократить мышцы и брюшной мембраны, как попродемонстрировано для фиктивной хирургии. Поместите 2,5-миллилитровый шприц под мышь. Смочите два ватных тампона с PBS, затем осторожно потяните кишечник в сторону с пинцетом и поместите тампоны для идентификации левого мочеточника.

Используйте пинцет, чтобы поднять левую почку. Используйте 4-0 шелка, чтобы ligate левый мочеточник в двух местах примерно на один сантиметр друг от друга. Вырезать мочеточник в центральной точке двух лигов, а затем использовать 4-0 нейлоновых швов, чтобы закрыть брюшной мембраны и разрез.

После резки брюшной мембраны, как было продемонстрировано ранее, поднимите его пинцетом и используйте хирургические ножницы, чтобы сделать боковой разрез на верхнем краю, а затем продолжить разрез вдоль самого низкого края ребер. Определите левую почку и рефлюкс его с PBS до тех пор пока почка не станет желто-белой. Удалите почку, разрезав левую почечную артерию и вену хирургическими ножницами и поместите ее в чашку Петри, затем тщательно промойте ее с помощью PBS.

Разрежьте почку примерно на 10-миллиграммовые образцы хирургическими ножницами и пинцетом, положите каждый кусок почки в свою 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку и закройте крышку трубки. Положите образец почки в силиконовый гомогенизатор и добавьте 700 микролитров реагента на основе фенила/гуанидина. Медленно нажмите и поверните пестик гомогенизатора против образца почки, чтобы гомогенизировать его.

Повторите нажатие и скручивание до тех пор, пока образец полностью не растворится в реагенте лиза. Для дальнейшей гомогенизации образца, передача гомогенизированного лизата в биополимер спина колонки и спина его на 14000 раз G в течение трех минут, а затем передать осажденный лизат в неиспользованные 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки. Смешайте лизат в трубке со 140 микролитров хлороформа и крышка трубки плотно.

Чтобы смешать лизат и хлороформ, инвертировать трубку 15 раз. Инкубировать образцы в течение двух-трех минут при комнатной температуре, а затем спина их на 12000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Не нарушая осадка, перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитров и добавьте в 1,5 раза ее объем в 100% этанола.

Вихрь смеси в течение пяти секунд. Загрузите 700 микролитров образца на мембранную колонку в двухми миллилитровой трубке. Закройте крышку столбца и вращайте колонку 15 000 раз G в течение 15 секунд, а затем выбрось осажденный лисат в трубке сбора.

Тщательно промыть образец, добавив 700 микролитров буфера мытья один к мембране якорь спина колонки в двухми миллилитровой трубки сбора. Затем повторите центрифугу и выбросит коллекторную трубку. Повторите мыть дважды с 500 микролитров мыть буфера два за стирку.

После последней стирки, спина мембраны якорь спина колонки в двухми миллилитровую трубку сбора на 15000 раз G в течение одной минуты и выбросить осажденный лисат. Перенесите мембранную колонку спина в новую 1,5-миллилитровую трубку. Растворите общую РНК, добавив 30 микролитров воды без RNase к колонке, закройте крышку столбца и оставьте ее на пять минут при комнатной температуре.

Затем вращай столбец 15 000 раз G в течение одной минуты. Перенесите образец, содержащий общую РНК, в новую микроцентрифуговую трубку на льду и измерьте концентрацию общей РНК с помощью спектрофотометрии. Подготовьте мастер-микст-решение в соответствии с рукописными указаниями и добавьте восемь микролитров к каждой трубе из восьми хорошо трубчатой полосы.

После корректировки общей плотности РНК поместите 12-микролитер алицит общей РНК в каждую трубку и закройте крышку. Центрифуга труб в течение 15 секунд. Положите трубки в термоциклер и инкубировать их в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию.

После завершения, немедленно инкубировать их в течение пяти минут при 95 градусов по Цельсию для синтеза cDNA. Перенесите cDNA в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку и разбавляют ее 10 раз дистиллированной водой. Vortex и центрифуга трубки в течение пяти секунд, а затем выполнить количественные ПЦР в режиме реального времени, как описано в тексте рукописи.

Этот протокол был использован для создания односторонней урефальной модели обструкции мыши через левую мочегонное перевязку у восьминедельных мышей мужского пола весом от 20 до 25 граммов. Уретры были полностью затруднены двойной перевязкой с 4-0 шелковыми швами. Почки были собраны в восемь дней после операции.

Данные microRNA qRT-PCR показали, что уровень микроРНК 3070-3p был значительно увеличен, а уровни микроРНК, 7218-5p и микроРНК 7219-5p были снижены в почках мышей UUO по сравнению с контролем. При попытке этого протокола, не забудьте повторить скручивания образца почки, пока он полностью растворяется в фенил / гуанидин основе лиза реагент для достижения хорошей экстракции РНК.