Скелетный фенотип анализ условной модели удаления Stat3 мыши

Генетически модифицированные модели мышей являются мощными инструментами для изучения механизмов заболеваний человека in vivo. Анализ скелетного фенотипа мышей является основой скелетных исследований. Эта частица описывает некоторые типичные методы анализа скелетного фенотипа, которые могут быть интересны тем, кто плохо знаком с исследованиями скелетных тканей.

При попытке использовать эту частицу имейте в виду, что эксперименты на животных требуют времени, поэтому собирайте как можно больше высококачественных образцов во время каждого эксперимента, даже если они вам не нужны в краткосрочной перспективе. Начните с того, что поместите усыпленную мышь в положение лежа на спине и аккуратно вывихните двусторонние тазобедренные суставы рукой. С помощью офтальмологических ножниц вертикально срезайте кожу с дистального отдела большеберцовой кости, а затем удалите всю кожу с задней конечности.

Отрежьте ножницами суставную связку правого тазобедренного сустава и коленного сустава, чтобы отделить заднюю конечность. Затем разрежьте кость с обоих концов, чтобы полностью погрузить кость в 4% PFA. Вырезаем вертел и место соединения малоберцовой кости.

Погрузите заднюю конечность в 4% PFA, оставляя правую заднюю конечность для парафинового среза. Разрежьте ножницами суставные связки левого тазобедренного и коленного суставов и аккуратно удалите мягкие ткани. Отделите большеберцовую и бедренную кости и погрузите их отдельно в 75% этанол.

Бедренные кости для микрокомпьютерной томографии и голени для кальцеина и ализарина имеют красную двойную маркировку. Чтобы приготовить парафиновые срезы, аккуратно промойте неподвижную правую заднюю конечность три раза PBS в течение 10 минут за одну промывку. Затем декальцифицируйте его до 15% ЭДТА с помощью ультразвукового декальцинатора в течение трех-четырех недель, пока кости не смогут согнуться, заменяя жидкость для удаления накипи через день.

После декальцификации образцы трижды промыть PBS и погрузить их в 75% этанол при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На второй день последовательно погрузите образцы в 95% этанол, 100% этанол и ксилол на один час каждый. Погрузите образцы в половину ксилола и половину парафина на 30 минут, затем в парафин при температуре 65 градусов Цельсия на ночь.

Чтобы вживить образец, погрузите его в парафин, расположив бедренную и большеберцовую кости под углом 90 градусов. Когда парафин полностью остынет, извлеките образцы из емкости для заделки. Пронумеруйте и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи.

Выпекайте парафиновые срезы при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут, затем очистите их от воска, погрузив в ксилол на 10 минут. Каждый раз погружайте секции по три раза со свежим ксилолом. Восстановите секции, погрузив их последовательно в 100% этанол, 95% этанол, 70% этанол и дистиллированную воду на пять минут каждая.

Приготовьте раствор для окрашивания с помощью набора для окрашивания TRAP и нагрейте его до 37 градусов Цельсия. Добавьте от 50 до 100 микролитров раствора для окрашивания в каждую секцию и инкубируйте их во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. Каждые пять минут проверяйте состояние окрашивания остеокластов под световым микроскопом до тех пор, пока не будут видны красные многоядерные остеокласты.

Затем завершите реакцию водой. Закрасьте срезы в растворе гематоксилина на 30 секунд и создайте устойчивый синий цвет, погрузив их в 1%-ный раствор аммиака на одну минуту. Затем промойте их в медленно проточной воде из-под крана.

Смонтируйте секции с помощью покровных стекол с нейтральным бальзамом и просушите их на ночь. Захватите от трех до пяти полей зрения с помощью микроскопа и проанализируйте трабекулярный периметр с помощью изображения J. Используйте инструмент прямой линии, чтобы измерить длину масштабной линейки как L1. Затем с помощью инструмента Сегментированная линия измерьте длину трабекулярного периметра как L2. Рассчитайте физическую длину и подсчитайте количество TRAP-положительных клеток с более чем тремя ядрами. После фиксации аккуратно трижды промойте голени PBS и последовательно погрузите образцы в 95% этанол, 100% этанол и ксилол на пять минут каждая.

Погрузите образцы в ацетон на 12 часов и половину ацетона и половину смолы на два часа, а также в чистую смолу в сушильную печь на ночь. Добавьте чистую смолу в подходящий резервуар для заделки силикагеля и поместите образцы в резервуар, избегая образования пузырьков. Полимеризуйте смолу в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Непрерывно разрежьте образцы на участки толщиной пять микрометров с помощью вращающегося микротома и храните остальные образцы с адсорбентом при комнатной температуре. Приклейте секции пинцетом в капле 75% этанола и закрепите их покровными листами с использованием нейтрального бальзама. Захватите красную и зеленую флуоресцентную маркировку с помощью флуоресцентного микроскопа.

Для изучения влияния делеции Stat3 на дифференцировку остеокластов были получены мыши, специфичные для остеокластов. Реконструкция бедренной кости и количественный анализ с помощью микрокомпьютерной томографии показали, что костная масса мышей Stat3 Ctsk была увеличена по сравнению с мышами дикого типа. Гистоморфология бедренной кости мышей дикого типа и Stat3 Ctsk была изучена с помощью окрашивания H и E.

Остеокластогенную активность выявляли с помощью окрашивания TRAP. Остеокласты — это крупные TRAP-положительные клетки с несколькими ядрами. Количество TRAP-положительных остеокластов было ниже у мышей Stat3 Ctsk по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на то, что дефицит Stat3 нарушает образование остеокластов.

Остеогенез измеряли с помощью двойного мечения кальцеином и ализариновым красным. Область между кальцеином и красной флуоресценцией ализарина представляет собой новообразованную кость. Удаленный Stat3 в остеокластах не влиял на анаболизм костей.

Сагиттальные парафиновые срезы, в которых хрящи впоследствии стали симметричными, что показало, что здесь использована четкая М-образная линия. В исследования мы включим больше характеристик скелетной системы, таких как механические свойства.