Доклиническая контролируемая модель кортикального воздействия при травматическом кровоизлиянии, контузии и нейровоспалении

Внутрипаренхиматозное кровоизлияние и нейровоспаление, сопровождающиеся ушибом головного мозга, могут спровоцировать тяжелое вторичное повреждение головного мозга. В этом протоколе подробно описывается модель контролируемого кортикального воздействия (CCI) у мышей, что позволяет исследователям изучать кровоизлияние, ушиб и посттравматические иммунные реакции, а также изучать потенциальные методы лечения.

Эта модель может быть использована для изучения патологий, связанных с ушибом головного мозга, включая внутричерепное кровоизлияние, токсичность железа, гибель нейронов, повреждение аксонов, неврологический дефицит и нервное воспаление. Основное преимущество этой методики заключается в том, что тяжесть повреждения головного мозга можно легко контролировать, манипулируя биохимическими параметрами, такими как скорость и смертность удара по устройству CCI. Индуцированное ЧМТ фокальное повреждение коры головного мозга обладает высокой воспроизводимостью.

Правильная стереотаксическая техника и процедура трепанации черепа являются основными определяющими факторами в создании стабильного и воспроизводимого повреждения головного мозга, вызванного ЧМТ. В целом, исследователь, новичок в этой процедуре, будет бороться с тем, чтобы стабилизировать мышь на стериотексическом каркасе и сделать соответствующую трепанацию черепа. Демонстрировать процедуру будет г-жа Джхи Шуан Линь, лаборант из моей лаборатории.

Начните с подтверждения отсутствия рефлекса защемления пальцев ног у животного, чтобы убедиться, что оно должным образом обезболито. Побрейте голову мыши электрическими машинками для стрижки в каудальном и ростральном направлении. Но не стоит обрезать усы.

Поместите мышь на стереотаксическую рамку и осторожно вставьте ушные планки в ушные каналы, убедившись, что головка мыши стабилизирована обеими ушными планками в равной степени. Поддерживайте анестезию на уровне от одного до 2% изофлурана в течение всей операции. Нанесите вазелин на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время операции.

Затем с помощью стерильных ватных тампонов продезинфицируйте бритую голову бетадином с последующим добавлением 70% этанола. Введите 100 микролитров 0,25% бупивакаина подкожно с помощью иглы инсулина 31 калибра и мягко помассируйте место инъекции для лучшего усвоения. Сделайте продольный разрез по средней линии на волосистой части головы с помощью скальпеля или ножниц.

Затем с помощью гемостата стяните кожицу с правой стороны. Дайте обнаженному черепу высохнуть в течение одной минуты. Затем удалите остатки крови и тканей на черепе стерильным ватным тампоном.

Проверьте, чтобы голова животного находилась на одном уровне в горизонтальной плоскости и определите анатомические ориентиры, брегму и лямбду, отметив оба места карандашом. Убедитесь, что голова животного находится на одном уровне в рострально-каудальном направлении, измерив Z-координаты как Брегмы, так и Лямбды. Используйте ту же процедуру для горизонтального положения головы.

Используйте инсулиновую иглу 31 калибра для определения места краниэктомии. Установите начало координат XY на Брегму и сдвиньте иглу на три миллиметра вправо. Отметьте это положение как место краниэктомии и нарисуйте карандашом на черепе круг диаметром четыре миллиметра.

Вырежьте вдоль карандаша намеченный круг с помощью высокоскоростного микросверла с трепаном, чтобы создать открытое отверстие диаметром четыре миллиметра. Снимите костный лоскут пинцетом и храните его в ледяном обычном физиологическом растворе. Аккуратно промойте отверстие физиологическим раствором, прежде чем надавливать на поверхность мозга, чтобы остановить кровотечение.

На устройстве CCI установите закругленный наконечник ударного элемента диаметром 2,5 мм под углом 22,5 градуса. Прикрепите ударный наконечник к дюралевой поверхности и установите параметры удара на блоке управления на скорость четыре метра в секунду и глубину деформации два миллиметра. Втяните металлический наконечник.

Разрядите поршень, чтобы создать удар по мозгу. Затем положите стерильный ватный тампон на травмированный участок, чтобы остановить кровотечение. Замените костный лоскут и закрепите его стоматологическим цементом.

Закройте кожу головы тканевым клеем. Поместите мышь под тепловую лампу в чистую клетку для восстановления с подстилкой до полного восстановления. Правильная стереотаксическая техника и процедура краниэктомии являются основными факторами, определяющими развитие стабильного и воспроизводимого повреждения головного мозга, вызванного ЧМТ.

Идеальная процедура краниэктомии должна вызвать минимальное гистологическое повреждение в искусственно прооперированном мозге. Изменения в повреждении головного мозга и потере мозолистого тела наблюдались на 1, 3, 7 и 28 день после ЧМТ. Кроме того, односторонняя атрофия мозга на стороне ушиба наблюдалась на 28-й день после ЧМТ.

Нейровоспаление выявлено по Iba1-положительной активированной микроглии и накоплению макрофагов вокруг границы области контузии. Внутрипаренхиматозное кровоизлияние также было обнаружено по Ly76-положительному окрашиванию с первого по седьмой день после ЧМТ. Смесь эритроцитов с разорванной и интактной морфологией клеток наблюдалась на седьмой день после ЧКВ, что позволяет предположить, что эритроциты были лизированы на этой стадии.

Это явление согласуется с наблюдением о том, что осаждение трехвалентного железа было обнаружено в области контузии с седьмого по 28-й день после ЧКВ. Активированные микроглии и макрофаги наблюдались в полосатом теле на удалении от места ушиба с 3-го по 28-й день после ЧКВ, что указывает на мозолистые и полосатые повреждения. Этот метод открывает исследователям путь к дальнейшему изучению нейровоспаления, вызванного кровоизлиянием в мозг, путем понимания реакции иммунных клеток, таких как микроглия, на ушиб кровоизлияния.