Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

Привет. Так что это небольшой РНК северного протокола. Это производная протокола, первоначально оптимизированного доктором Рашидом Акбергеновым.

В этом методе, можно обнаружить небольшие РНК в любом месте между 20-24 нуклеотидов в длину, очень точно и с очень высоким разрешением. Протокол в основном модифицированная форма традиционного северного анализа, но здесь процент акриламида довольно высок, это 15 процентов. Этот север может быть использован для обнаружения уже известных малых РНК, либо микро РНК или другой набор малых РНК, когда последовательность известна или она может быть использована для подтверждения обилия небольшой РНК из следующего поколения секвенирования наборов данных.

Преимущество этого метода заключается в том, что можно не только посмотреть на изобилие микро РНК, но и обилие прекурсоров, например микро РНК может оставить предшественник, который составляет около 30 может быть несколько сотен нуклеотидов долго, это также может быть обнаружено одновременно, наряду с микро РНК. Протокол очень прост, очень прямо вперед, но нужно быть очень осторожным при выполнении некоторых критических шагов, которые перечислены в конце этого протокола. Для приготовления смеси геля 10 мл добавьте 4,8 грамма мочевины, 3,75 мл раствора 40%акриламида и 1 мл свежеприготовленного 10X TBE, pH 8.2 и аккуратно перемешайте раствор.

Растворите мочевину полностью, нагревая смесь на водяной бане, пока раствор не будет вы выясок. Составить объем до 10 мл, используя стерильную воду Милли и охладить гель смесь до комнатной температуры. Вымойте необходимый аппарат с моющим средством, скраб их осторожно, чтобы удалить остаточные TBE и акриламид.

Далее промойте их водой Милли и дайте ей высохнуть. Соберите стеклянную пластину вместе, убедитесь, что оба находятся на одном уровне. Поместите их твердо на губку.

Добавьте 8 микролитров TEMED и 80 микролитров 10% свежеприготовленного APS в гель-микс. Аккуратно перемешать и залить гель смесью для собранных пластин. Убедитесь, что гель не протекает.

Поместите гребень осторожно. Дайте гелю полимеризуться в течение примерно 45 минут. После полимеризации геля снимите стеклянные пластины со сборки.

Вымойте стеклянные тарелки водой Милли. И поместите их в бегущую кассету. Поместите бегущую кассету внутрь бака.

Налейте свежеприготовленный 1X TBE, рН 8.2. Снимите гребень осторожно. Вымойте колодцы геля тщательно путем трубопроводов буфера.

Этот шаг удаляет осадки мочевины из хорошо и облегчает РНК для запуска равномерно через гель. Закройте крышку аппарата и предварительно запустите пустой гель на 80 вольт в течение 30 минут, чтобы проверить наличие утечки буфера. Для приготовления 10 мл погрузочного красителя, взвесить 5 мг бромофенола синего, 5 мг ксилена цианола и добавить 10 мл дейоинизированного формамида и хорошо перемешать.

Aliquot красителя и хранить на 4 градуса для дальнейшего использования. Aliquot 10 микрограмм общей РНК в стерильные 1,5 мл труб. Убедитесь, что качество РНК, т.е.

соотношение 260:230 больше или ближе к двум. Поместите трубку внутри speedVac и вакуум высушите образцы. Повторно приостанавливать высушенные образцы РНК в 8 микролитров погрузочного красителя.

Нагрейте образцы при температуре 98 градусов в течение двух минут. Охладить их в течение одной минуты при комнатной температуре. Vortex охлажденных образцов РНК для обеспечения надлежащей повторной подвески в погрузке красителя.

Вращай трубки. Повторите шаги нагрева, охлаждения и вихря в течение трех раз для получения свободного течет РНК. Остановите предварительный запуск геля.

Тщательно промыть скважины, перед загрузкой образца, чтобы удалить отложения мочевины внутри скважин. Нагрейте повторно приостановленные образцы РНК при температуре 98 градусов в течение одной минуты. Загрузите образцы горячими в скважины с помощью капиллярных наконечников.

Избегайте введения пузырьков воздуха. Полная загрузка всех образцов и сборка крышки. Запустите гель на 80 вольт в течение трех часов или до бромофено синий работает полностью.

Используйте положительно заряженную нейлоновую мембрану для переноса. Вырежьте его до размеров стеклянной пластины. Наклеить этикетку на мембрану в правом верхнем углу.

Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды Milli' убедитесь, что место этикетки стороне вниз, лицом к поверхности воды. Возьмите чистый лоток и подготовить гель бутерброд для электро-передачи. Поместите серую сторону кассеты вниз.

Налейте 1X TBE немного выше уровня кассеты. Предварительно промокнуть волоконную прокладку в 1X TBE и сжать его, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вырезать два куска бумаги blotting размером с волокна колодки.

Предварительно мокрый кусок бумаги в 1X TBE и поместите его на волоконную прокладку. Удалите пузырьки воздуха, прокатки пластиковой пипетки над бумагой. Предварительно мокрый еще один кусок бумаги в 1X TBE и положить его на кассету.

Переверните, чтобы удалить пузырьки воздуха. Теперь установка сэндвича готова к электро-передаче. После завершения электрофорез, остановить запуск и снять крышку с аппарата.

Удалите бегущую кассету из установки. Вынул стеклянные пластины из бегущей кассеты. Аккуратно удалите гель из сборки.

Положите его на бумагу, так что первый загруженный образец РНК справа от вас. Аккуратно окуните предварительно пропитанную мембрану в 1X TBE и поместите ее над гелем, лицом к помеченной стороне вниз. Не позволяйте мембране и гелю высохнуть.

Аккуратно переверните, чтобы удалить пузырьк воздуха. Опустите один кусок бумаги в 1X TBE и положите его на мембрану. Удалите пузырьки воздуха.

Поместите еще один кусок бумаги и удалить пузырьки воздуха. Завершите сэндвич, заложив волоконную прокладку над сборкой. Закройте кассету твердо.

Поместите транс-помарку кассеты в модуль. Заполните бак с 1X TBE, рН 8.2, до blotting знака. Закройте крышку аппарата и перенесите на 10 вольт на ночь при 4 градусах или в холодном помещении.

Держите УФ крест linker готов и установить его до 1200, незадолго до завершения электро передачи. После завершения передачи снимите кассету с модуля. Поместите влажную мембрану на лист A4, поместив отмеченную сторону вверх.

Перекрестная связь РНК с мембраной путем облучения 254 нанометровым ультрафиолетовым светом при 120 миллиджолях. Поперечная помарка может храниться на четырех градусах или использоваться для гибридизации. Дизайн зонда, который является полностью бесплатным для небольшой РНК, которая должна быть обнаружена.

Конец этикетки зонда на его пять премьер-конец с помощью фермента PNK и объединить компоненты, как показано на. Инкубировать реакционной смеси при 37 градусах в течение 30 минут. После 30 минут инкубации используйте колонны G-25 для отделяния неописанной зондов от реакционной смеси.

Для улучшения маркировки зонда подготовьтесь к колонне G-25 перед использованием. Поместите пятно, РНК стороны лицом вверху, внутри бутылки гибридизации. Энергично смешивайте буфер гибридизации перед использованием.

Добавить 10 мл буфера гибридизации внутри и поместить бутылку гибридизации внутри печи гибридизации, поддерживать при 35 градусах с вращением. Выполните предварительную гибридизацию в течение 20-30 минут. После предварительной гибридизации вынюхив бутылку из духовки.

Аккуратно добавьте помеченный зонд в буфер гибридизации. Убедитесь, что пузырьки воздуха не создаются. Инкубировать пятно внутри духовки при температуре 35 градусов с вращением в течение 12 часов.

После гибридизации удалите буфер гибридизации из бутылки. Выполните быструю стирку помарки, используя буфер для мытья-I. Этот шаг выполняется для удаления избыточного решения гибридизации из пятен.

Далее инкубировать пятна при 35 градусах в течение 30 минут с помощью буфера мытья-I. Выполните еще одну стирку с помощью буфера-II при 35 градусах в течение 30 минут. После мытья помарки поместите ее в крышку гибридизации, удалите лишний буфер и запечатав его.

Поместите его в кассету и подвергните его свободному от радиации экрану фосфо-изображения в течение 12 часов. Обнаружить сигнал гибридизации с помощью тайфуна биомолекулярного изображения и проанализировать результаты с помощью программного обеспечения ImageJ. Для гибридизации помарки с другими зондами, выполните зачистки шаги, как показано на иллюстрации.

С помощью этого метода можно оценить обилие микро РНК, а также его длину. На этом изображении выражение микроРНК 397 может быть обнаружено во всех образцах. В этой помарке, обилие образца одно приблизительно 5 читает в миллион, в соответствии с данными последовательности следующего поколения, предлагая что наша техника может обнаружить более менее обильные микро RNAs слишком.

Кроме того, с помощью программного обеспечения для количественной оценки ImageJ можно количественно оценить выражение микро 397 среди образцов. Здесь мы использовали U6 и микро РНК 168 в качестве управления загрузкой. Я буду говорить о некоторых важных шагов, которые должны быть рассмотрены при выполнении эксперимента.

Убедитесь в том, чтобы использовать хорошее качество РНК для подготовки образца. В то время как вакуум сушки образцов, избежать более сушки их. Повторное приостановление РНК в погрузочном красителе имеет решающее значение.

Убедитесь в том, чтобы подготовить свободный струящийся образец. Необходимо позаботиться о загрузке геля. Скважины геля должны быть вымыты и образец должен быть загружен по прямой линии внутри колодцев.

Во время электро переноса, распространения мембраны в воде, перед погружением в 1X TBE имеет важное значение, это улучшает передачу. Гибридизация помарки должна быть выполнена при 35 градусах. Поддерживайте температуру духовки гибридизации.

Для повторного использования помарки, мембраны должны храниться при 4 градусах. Они должны быть влажными в 2X SSE. В отличие от других методов, основанных на ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку выражения, а также определение размера микро РНК.