In vitro нейромышечная развязка, индуцированная из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Здесь мы предоставляем протокол для генерации в пробирке NMJs из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Этот метод может вызвать NMJs со зрелой морфологией и функции в 1 месяц в одной хорошо. Полученные NMJ потенциально могут быть использованы для моделирования связанных заболеваний, для изучения патологических механизмов или для проверки лекарственных соединений для терапии.

Эта система индукции нервно-мышечного соединения человека может быть использована для индуцирования формирования до- и постсинаптических компонентов, включая моторные нейроны, скелетные мышцы и клетки Шванн. Не только зрелая, сложная структура NMJ может быть получена в одном блюде культуры от одной исходной популяции клеток, но в результате NMJ также обладает способностью к контракту. Этот метод имеет потенциал для изучения нервно-мышечных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия, и для терапевтического скрининга соединения.

Дифференцированный NMJ является очень толстой, сложной тканью, и это трудно визуализировать. Демонстрируя процедуру, мы можем проинструктировать читателей, как определить конкретные структуры. Вымойте клетки с тремя миллилитров PBS, прежде чем добавить один миллилитр клеточного раствора отряда в чашку Петри.

Через 10 минут при 37 градусах по Цельсию добавьте три миллилитров эмбриональной стволовой клетки приматов к каждому хорошо и осторожно пипетку три раза, чтобы отмежевать клетки от крышки. Далее, бассейн отдельных стволовых клеток, содержащих supernatants в 50 миллилитров конической трубки для центрифугации и повторного высасывания гранул стволовых клеток в трех миллилитров свежих приматов эмбриональной стволовой клетки среды дополнен 10 микромолярной Y-27632 ROCK ингибитор для подсчета. Затем разбавьте клетки в два раза от 10 до пяти клеток на миллилитр среды, дополненной концентрацией ингибитора ROCK, и верните два миллилитров клеток в каждый колодец внеклеточной матричной пластины с шестью колодецами.

Через 24 часа замените супернатант в каждом колодец двумя миллилитров свежей эмбриональной стволовой клетки приматов, дополненной одним микрограммом на миллилитр доксициклина, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров дифференциации среднего, дополненных доксициклиным на колодец, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры на 10 дней. В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров миогенной дифференциации среды, дополненной доксициклином на колодец, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры еще на 10 дней.

В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров нервно-мышечной среды соединения на колодец и верните пластину в инкубатор клеточной культуры на 30 дней. В конце инкубации визуализируете дифференцированные нервно-мышечные соединения с помощью перевернутой микроскопии. Чтобы вызвать сокращения миотрубу, добавьте 25 миллимолярдного хлорида кальция в каждую колодец дифференцированных нервно-мышечных клеток соединения.

И в течение одной-двух минут лечения поместите пластину на сцену перевернутого микроскопа. Используя микроскопию живых клеток, завехайте фильм о сокращении миотруба в течение 20 секунд. В конце записи добавьте 300 нанограмм на миллилитр кураре в культурную среду и зарегистрируете фильм еще на 20 секунд, прежде чем открыть файл фильма в соответствующей программе анализа векторов движения для анализа.

Иммунофторесцентное окрашивание нейрофиламентных синаптических сосудов и рецепторов ацетилхолина может быть выполнено для идентификации нейронов. Моторные нейроны могут быть определены TUJ 1 и островок 1 окрашивания, в то время как пост-синаптические миотрубы могут быть определены путем окрашивания для миозин тяжелой цепи. Клетки Шванн могут быть помечены антителами S-100.

На этих сканирующих изображениях электронной микроскопии морфология зрелых нервно-мышечных соединений может наблюдаться с четкой визуализацией расширенных аксоновых терминалов, аксонов и мышечных волокон. Передача электронной микроскопии может быть использована для визуализации зрелой ультра структуры нервно-мышечных компонентов, в том числе пресинаптического аксонового терминала с синаптической пузырьками и постсинаптической области, которая разделена синаптической расщелиной. Складки соединения отмечают соединение между нейронами и мышечными волокнами.

Здесь показаны зрелые аксонные терминалы, содержащие синаптические пузырьки. В совокупности эти морфологические особенности указывают на то, что нервно-мышечные компоненты были хорошо индуцированы и созрели. Функциональная оценка клеток показывает, что видные нервно-мышечные сигналы движения соединения могут быть вызваны хлоридом кальция и что эти сокращения могут быть прерваны кураре, подтверждающим, что сигналы моторных нейронов передаются через нервно-мышечный перекресток, чтобы вызвать сокращение мышц.

Плотность посева клеток влияет на эффективность образования NMJ. Он может быть изменен, чтобы адаптироваться к протоколу, в соответствии с экспериментальными целями. Эта нейромышечная культура соединения содержит несколько типов клеток, и эти компоненты могут быть использованы для изучения взаимодействия между этими клетками во время развития нервно-мышечного соединения или в ответ на конкретные патологии заболевания.