In vitro нейромышечная развязка, индуцированная из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток
3 декабря 2020 г.
Здесь мы предоставляем протокол для генерации в пробирке NMJs из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Этот метод может вызвать NMJs со зрелой морфологией и функции в 1 месяц в одной хорошо. Полученные NMJ потенциально могут быть использованы для моделирования связанных заболеваний, для изучения патологических механизмов или для проверки лекарственных соединений для терапии.
Эта система индукции нервно-мышечного соединения человека может быть использована для индуцирования формирования до- и постсинаптических компонентов, включая моторные нейроны, скелетные мышцы и клетки Шванн. Не только зрелая, сложная структура NMJ может быть получена в одном блюде культуры от одной исходной популяции клеток, но в результате NMJ также обладает способностью к контракту. Этот метод имеет потенциал для изучения нервно-мышечных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия, и для терапевтического скрининга соединения.
Дифференцированный NMJ является очень толстой, сложной тканью, и это трудно визуализировать. Демонстрируя процедуру, мы можем проинструктировать читателей, как определить конкретные структуры. Вымойте клетки с тремя миллилитров PBS, прежде чем добавить один миллилитр клеточного раствора отряда в чашку Петри.
Через 10 минут при 37 градусах по Цельсию добавьте три миллилитров эмбриональной стволовой клетки приматов к каждому хорошо и осторожно пипетку три раза, чтобы отмежевать клетки от крышки. Далее, бассейн отдельных стволовых клеток, содержащих supernatants в 50 миллилитров конической трубки для центрифугации и повторного высасывания гранул стволовых клеток в трех миллилитров свежих приматов эмбриональной стволовой клетки среды дополнен 10 микромолярной Y-27632 ROCK ингибитор для подсчета. Затем разбавьте клетки в два раза от 10 до пяти клеток на миллилитр среды, дополненной концентрацией ингибитора ROCK, и верните два миллилитров клеток в каждый колодец внеклеточной матричной пластины с шестью колодецами.
Через 24 часа замените супернатант в каждом колодец двумя миллилитров свежей эмбриональной стволовой клетки приматов, дополненной одним микрограммом на миллилитр доксициклина, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров дифференциации среднего, дополненных доксициклиным на колодец, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры на 10 дней. В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров миогенной дифференциации среды, дополненной доксициклином на колодец, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры еще на 10 дней.
В конце инкубации замените супернатанты двумя миллилитров нервно-мышечной среды соединения на колодец и верните пластину в инкубатор клеточной культуры на 30 дней. В конце инкубации визуализируете дифференцированные нервно-мышечные соединения с помощью перевернутой микроскопии. Чтобы вызвать сокращения миотрубу, добавьте 25 миллимолярдного хлорида кальция в каждую колодец дифференцированных нервно-мышечных клеток соединения.
И в течение одной-двух минут лечения поместите пластину на сцену перевернутого микроскопа. Используя микроскопию живых клеток, завехайте фильм о сокращении миотруба в течение 20 секунд. В конце записи добавьте 300 нанограмм на миллилитр кураре в культурную среду и зарегистрируете фильм еще на 20 секунд, прежде чем открыть файл фильма в соответствующей программе анализа векторов движения для анализа.
Иммунофторесцентное окрашивание нейрофиламентных синаптических сосудов и рецепторов ацетилхолина может быть выполнено для идентификации нейронов. Моторные нейроны могут быть определены TUJ 1 и островок 1 окрашивания, в то время как пост-синаптические миотрубы могут быть определены путем окрашивания для миозин тяжелой цепи. Клетки Шванн могут быть помечены антителами S-100.
На этих сканирующих изображениях электронной микроскопии морфология зрелых нервно-мышечных соединений может наблюдаться с четкой визуализацией расширенных аксоновых терминалов, аксонов и мышечных волокон. Передача электронной микроскопии может быть использована для визуализации зрелой ультра структуры нервно-мышечных компонентов, в том числе пресинаптического аксонового терминала с синаптической пузырьками и постсинаптической области, которая разделена синаптической расщелиной. Складки соединения отмечают соединение между нейронами и мышечными волокнами.
Здесь показаны зрелые аксонные терминалы, содержащие синаптические пузырьки. В совокупности эти морфологические особенности указывают на то, что нервно-мышечные компоненты были хорошо индуцированы и созрели. Функциональная оценка клеток показывает, что видные нервно-мышечные сигналы движения соединения могут быть вызваны хлоридом кальция и что эти сокращения могут быть прерваны кураре, подтверждающим, что сигналы моторных нейронов передаются через нервно-мышечный перекресток, чтобы вызвать сокращение мышц.
Плотность посева клеток влияет на эффективность образования NMJ. Он может быть изменен, чтобы адаптироваться к протоколу, в соответствии с экспериментальными целями. Эта нейромышечная культура соединения содержит несколько типов клеток, и эти компоненты могут быть использованы для изучения взаимодействия между этими клетками во время развития нервно-мышечного соединения или в ответ на конкретные патологии заболевания.
Обзор
В данном протоколе описывается создание нервно-мышечных соединений (НМС) in vitro из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека. Этот метод позволяет получить зрелые НМС с функциональными возможностями в течение одного месяца, что представляет собой ценный инструмент для моделирования заболеваний и скрининга лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Регенеративная медицина
Теоретические сведения
- НМС имеют решающее значение для сокращения мышц и двигательной функции.
- Изучение НМС может дать представление о нервно-мышечных заболеваниях.
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) человека являются возобновляемым источником для исследования НМС.
- Современные методы создания НМС часто сложны и требуют много времени.
Цель исследования
- Разработать оптимизированный протокол формирования НМС из иПСК.
- Облегчить изучение нервно-мышечных заболеваний.
- Обеспечить возможность скрининга лекарственных препаратов для терапевтического вмешательства.
Используемые методы
- Методы культивирования клеток для дифференцировки иПСК в компоненты НМС.
- Использование специфических сред и добавок для стимуляции созревания.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание для идентификации нейрональных и мышечных компонентов.
- Функциональные тесты для оценки активности и сократимости НМС.
Основные результаты
- Были успешно сформированы зрелые НМС с функциональными возможностями.
- Хлорид кальция индуцировал сокращения в миотрубках.
- Кураре эффективно блокировал мышечные сокращения, подтвердив функциональность НМС.
- Методы визуализации позволили детально изучить морфологию НМС.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод создания нервно-мышечных соединений (НМС) из иПСК.
- Эта система может быть использована для изучения взаимодействий при развитии НМС.
- Потенциальные области применения включают моделирование заболеваний и тестирование терапевтических соединений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эта модель нервно-мышечного синапса (НМС) человека in vitro, полученная из иПСК, представляет собой физиологически релевантную систему для изучения механизмов нервно-мышечных заболеваний и оценки терапевтических соединений. Благодаря интеграции пре- и постсинаптических компонентов с функциональной связностью, модель позволяет проводить валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска лекарств. Срок созревания в один месяц и надежные показатели функционального анализа обеспечивают возможность масштабируемой разработки тестов для идентификации ведущих соединений и повышения прогностической уверенности в трансляционных исследованиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем моделирования формирования и функционирования НМС в системе, релевантной для человека.
- Эксплуатационная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет комплексной оценки взаимодействия мотонейронов, скелетных мышц и шванновских клеток.
- Прогностическая ценность: облегчает сортировку портфеля препаратов, обеспечивая количественные показатели целостности НМС и сократительного ответа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимая платформу для скрининга соединений с функциональными конечными точками, связанными с активностью НМС.
- Операционная ценность: Позволяет проводить масштабируемые анализы в многолуночном формате, используя одну исходную популяцию iPSC в одной культуральной чашке.
- Готовность анализа: Позволяет получать зрелые НМС с детектируемыми ответами на сокращение и ингибирование, подходящими для высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает переход от фундаментальных открытий к доклинической валидации за счет моделирования патофизиологии нервно-мышечных соединений (НМС) человека и ответа на лекарственную терапию.
- Механистическое снижение рисков: позволяет изучать нарушение НМС в моделях заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия, с использованием определенных генетических фонов.
- Прогресс с поправкой на риск: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе функциональных показателей НМС, которые коррелируют с иннервацией мышц in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, предоставляя возможность повторного использования системы, релевантной для человека, в исследованиях нервно-мышечной системы.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез о формировании, поддержании и дисфункции НМС в генетических моделях заболеваний или моделях, индуцированных токсикантами.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу НМС с функциональными показателями сокращения и ингибирования для оценки влияния соединений на нервно-мышечную передачу.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные о подвижности миотрубок и фармакологическом ингибировании, что делает возможным сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований с использованием НМС, полученных из иПСК, путем моделирования специфических для человека нервно-мышечных взаимодействий и патологий.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую платформу на основе плюрипотентных стволовых клеток, применимую для множества неврологических показаний и кампаний по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования за счет снижения механистической неопределенности при разработке терапевтических средств, нацеленных на НМС.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость благодаря четко определенному протоколу дифференцировки в одной лунке.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять недостатки в воздействии на нервно-мышечную систему и снижая риск неудач на поздних стадиях разработки.
- Влияние на портфель: обеспечивает возможность приоритизации соединений с учетом рисков на основе функциональных результатов формирования НМС и степени взаимодействия с мишенью.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт работы с культурами и дифференцировкой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека, а также знания в области нейромышечной биологии.
- Зависит от специализированных сред, добавок (включая доксициклин и ингибитор ROCK) и подложек, покрытых внеклеточным матриксом.
- Необходимы стандартизированные протоколы плотности посева клеток, смены сред и времени проведения функциональных анализов.
- Требуется учитывать особенности адаптации при масштабировании для различных линий иПСК и генетических фонов моделей заболеваний.
- Включает практические ограничения, такие как сложность визуализации из-за формирования толстых многослойных тканей, что требует применения передовых методов микроскопии.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Culture
2:00
iPSC Differentiation
3:04
Neuromuscular Junction (NMJ) Muscle Contraction and Curare Treatment
3:47
Results: Representative NMJ Phenotypic, Morphological, and Functional Characterization
5:20
Conclusion
