Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени
11 марта 2021 г.
В этом протоколе представлен метод измерения связывания адениновых нуклеотидов с рецепторами в режиме реального времени в клеточной среде. Связывание измеряется как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между производными тринитрофенилнуклеотидов и белком, меченным неканонической флуоресцентной аминокислотой.
Поскольку АТФ является важным клеточным мессенджером, мы разработали метод, который позволяет нам измерять связывание АТФ с его рецепторами с высокой точностью. Используя FRET между производными нуклеотидов и флуоресцентно меченными белками, мы можем контролировать связывание нуклеотидов с интактными функциональными рецепторами в режиме реального времени и с отличным пространственным разрешением. Мы используем этот метод, чтобы понять влияние клеточного метаболизма на чувствительный к АТФ калиевый канал, который участвует в определенных формах диабета.
Чтобы провести эксперимент с мембраной без крыши, сначала используйте пару щипцов, чтобы вырвать небольшой фрагмент из покровного стекла с трансфицированными клетками и промыть фрагмент PBS. Если покровное стекло предварительно покрыто полилизином, поместите фрагмент на дно 35-миллиметровой тарелки, содержащей два миллилитра PBS, и держите ультразвуковой аппарат с трехмиллиметровым зондом на три-пять миллиметров над образцом, пульсирующий с мощностью 50 Вт и амплитудой от 20 до 40% в течение 200-500 миллисекунд, чтобы разблокировать ячейки. Если покровные шликеры не покрыты предварительным покрытием, после промывки PBS окуните фрагмент в пробирку, содержащую 0,1% поли-L-лизина, примерно на 30 секунд, прежде чем вскрывать клетки с помощью краткой обработки ультразвуком, как показано на рисунке.
Перенесите обработанный ультразвуком фрагмент в покрытую стеклянным дном 35-миллиметровую тарелку, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на инвертированный микроскоп, оснащенный объективом с высокой числовой апертурой и 60-кратным погружением в воду. Убедитесь, что порт камеры микроскопа подключен к спектрографу последовательно с высокочувствительной ПЗС-камерой, и используйте перистальтический насос для перфузии камеры ванны с буфером со скоростью потока от 0,5 до одного миллилитра буфера в минуту. Чтобы идентифицировать фрагменты мембраны без крыши, экспрессирующие меченый ANAP канал, просмотрите образец, чтобы найти мембраны с флуоресцентными каналами.
Частично задействуйте маску спектрометра между портом камеры на микроскопе и спектрографом. Тень маски появится на изображении камеры. Получите яркое поле и флуоресцентное изображение непокрытой мембраны, чтобы можно было выбрать интересующую область для анализа.
Поднесите наконечник микрообъемной перфузионной системы близко к непокрытой мембране. Чтобы получить изображение флуоресценции ANAP, возбуждайте мембрану 385-нанометровым светодиодом через 390/18-нанометровый полосовой фильтр возбуждения и 416-нанометровый краевой дихроичный, собирая излучаемый свет через 400-нанометровый длинночастотный эмиссионный фильтр. Включите маску спектрометра и убедитесь, что излучаемый свет пропускается.
Совместите интересующую область с прорезью маски спектрометра. Задействуйте решетки спектрометра. Когда решетки установлены, свет, рассеиваемый спектрометром, будет проецироваться на чип ПЗС-камеры для получения спектральных изображений.
Изображения сохранят пространственную информацию в измерении Y. Измерение X будет заменено длиной волны. При перфузии буферным раствором без нуклеотидов получите одно или несколько экспозиций от 0,1 до десяти секунд для последующей коррекции и нормализации данных, собранных в течение остальной части эксперимента.
Затем нанесите диапазон концентраций ТНП АТФ в растворе ванны, чтобы установить кривую реакции на концентрацию, перфузируя каждый раствор в течение не менее одной минуты, чтобы обеспечить достижение устойчивого состояния и получить воздействие для каждой концентрации. После каждой концентрации промывайте АТФ ТНП раствором для ванны без нуклеотидов в течение не менее одной минуты, прежде чем получить изображение воздействия после обработки. Чтобы провести эксперимент с флуорометрией с пластырем, сначала вытащите пластырные пипетки из толстостенных капилляров из боросиликатного стекла до сопротивления от 1,5 до 2,5 мегаом при заполнении раствором пипетки.
Затем перенесите покровное стекло с трансфицированными ячейками в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на перевернутый микроскоп. Перфузируйте камеру ванны раствором для ванны и определите клетку, экспрессирующую каналы, меченные ANAP. Слегка надавите на пластырь-пипетку и поместите пипетку в ванну.
Прижмите пипетку к мембране клетки и аккуратно отсосите для достижения уплотнения в гигаом. Чтобы удалить пластырь, быстро отодвиньте держатель пипетки от заплатанной ячейки. Поднесите наконечник пластыря к кончику перфузионной системы и убедитесь, что пластырь находится в щели маски спектрометра.
Затем нанесите ТНП АТФ и соберите спектры изображений. На этих изображениях можно наблюдать типичный фрагмент мембраны из клетки HEK293T, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, помеченные оранжевым флуоресцентным белком. На этом спектральном изображении чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, в непокрытой мембране из клетки HEK293T, подвергшейся воздействию пяти микромолярных TNP ATP, можно наблюдать две области высокой интенсивности, которые соответствуют пиковому излучению ANAP и TNP АТФ.
Окончательный спектр может быть получен путем вычитания усредненного фонового спектра из усредненной области спектра интереса. Здесь можно наблюдать снижение пиковой флуоресценции ANAP после многократного воздействия. Пиковая флуоресценция от нескольких воздействий в отсутствие ТНП АТФ была подогнана к одному экспоненциальному распаду.
Затем эти данные были использованы для исправления артефактов фотообесцвечивания. Здесь показаны репрезентативные спектральные изображения с непокрытой мембраны, полученные из клетки, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, меченные ANAP, в отсутствие и присутствии TNP ATP. Наблюдение за скорректированными спектрами излучения показывает четкое разделение между донорным и акцепторным флуоресцентным излучением.
На этом рисунке показаны репрезентативные токи и спектры чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, из типичного эксперимента по флуорометрии с патч-зажимом. Спектры излучения скорректированы на фон и обесцвечивание, как показано для непокрытых мембран. Будьте осторожны с элементами управления, чтобы убедиться, что флуоресцентный сигнал специфичен для вашего рецептора.
Убедитесь, что ваше изобилие быстрое, эффективное и полное, и держите экспозицию как можно короче. Этот метод отвечает на вопросы о занятости рецепторов и о том, как она связана с функцией. Другие методы FRET, используемые с аналогичной установкой, могут исследовать индуцированные лигандом подтверждающие изменения в рецепторе.
Обзор
Этот протокол представляет метод измерения связывания аденин-нуклеотидов с рецепторами в реальном времени в клеточной среде. Используя передачу энергии резонансного Фёрстера (FRET) между производными нуклеотидов и флуоресцентно меткенными белками, исследователи могут контролировать связывание нуклеотидов с функциональными рецепторами с высокой точностью.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биофизика
Фон
- АТФ является важным клеточным мессенджером, участвующим в различных сигнальных путях.
- Понимание связывания АТФ с его рецепторами важно для изучения клеточного метаболизма.
- АТФ-чувствительный калиевый канал связан с определенными формами диабета.
- Техники измерения в реальном времени улучшают понимание динамики рецепторов.
Цель исследования
- Разработать метод для измерения в реальном времени связывания АТФ с рецепторами.
- Исследовать влияние клеточного метаболизма на АТФ-чувствительные калиевые каналы.
- Предоставить детальный протокол для проведения экспериментов в клеточной среде.
Используемые методы
- Измерение FRET с использованием тринитрофенильных производных нуклеотидов.
- Снятие крышки фрагментов мембраны из трансфектированных клеток.
- Использование микроскопии с высокой численной апертурой для визуализации.
- Патч-клемпная флуоресценция для анализа активности рецепторов.
Основные результаты
- Успешное измерение динамики связывания АТФ в реальном времени.
- Идентификация фрагментов мембраны без крышки, экспрессирующих флуоресцентно меткенные каналы.
- Установление кривых ответа на концентрацию для TNP АТФ.
- Ясное разделение флуоресцентных испусканий донора и акцептора наблюдается.
Выводы
- Разработанный метод позволяет точно следить за взаимодействиями АТФ с рецепторами.
- Результаты способствуют пониманию роли АТФ в клеточном метаболизме.
- Этот протокол может быть применен к дальнейшим исследованиям динамики и функции рецепторов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables real-time quantification of nucleotide binding to functional membrane proteins, providing mechanistic insights into ligand-dependent gating that can inform target validation for nucleotide-regulated receptors. By integrating binding measurements with functional readouts such as ion channel current, it supports de-risking of therapeutic hypotheses in discovery programs targeting metabolic and neurological disorders. The approach is adaptable to other receptors with suitable fluorescent ligands, offering a reusable platform for assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time occupancy of nucleotide-binding sites on intact, functional receptors to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables direct correlation of ligand binding with protein function via simultaneous current measurement in excised patches.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving ligand-dependent gating dynamics of targets like KATP channels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative concentration-response curves using TNP ATP derivatives to establish binding affinity and potency.
- Reproducibility: Uses standardized unroofed membrane and patch-clamp fluorometry setups to minimize variability across experiments.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging and spectral analysis for multi-condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to ATP-sensitive potassium channels implicated in certain forms of diabetes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges binding kinetics to functional outcomes, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic Insight: Reveals how nucleotide binding modulates channel activity, informing structure-function relationships in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing binding-function correlation data.
- Discovery Biology: Tests target engagement and pathway modulation by measuring nucleotide binding in native-like membrane environments.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding data suitable for hit confirmation and SAR development.
- Analytics: Produces corrected emission spectra and binding isotherms that enable comparison of ligand efficacy and potency.
- Translational Research: Links binding events to functional readouts in disease-relevant systems such as metabolically active cells.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other nucleotide-regulated proteins or receptors with compatible fluorescent ligands, supporting platform-level investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on ligand-receptor interactions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes real-time binding measurements with spatial and temporal resolution in intact membranes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement with functional correlation.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on binding kinetics and functional impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular tagging with non-canonical amino acids like ANAP and FRET-based detection.
- Depends on instrumentation including spectrograph-equipped microscopes, high-sensitivity CCD cameras, and microvolume perfusion systems.
- Necessitates standardization of membrane preparation (unroofed or excised patches) and buffer conditions across teams.
- Adaptation to other systems requires identification of suitable fluorescent nucleotide derivatives and compatible protein tags.
- Potential limitations include photobleaching artifacts and the need for careful controls to ensure signal specificity, as noted in the data treatment section.
