Рядом с одновременным лазерным сканированием конфокаловой и атомной микроскопии силы (Conpokal) на живых клетках

Conpokal сочетает в себе конфокаловую микроскопию с атомной микроскопией силы с помощью зонда, чтобы ткнуть поверхность образца. Хотя оба метода эффективны индивидуально, Conpokal облегчает коалексию флуоресценции с механической характеристикой. Основным преимуществом техники Conpokal является почти одновременное двойное микроскопия.

Confocal исследует цитоскелетные и другие клеточные процессы до и после зондирования AFM, который обеспечивает области специфические механические свойства. Этот метод является ударным в области механобиологии, как, например, клетки мозга могут быть исследованы в физиологических условиях для изучения электрических импульсов и силы сделки. Перед началом анализа выберите соответствующий кантилевер AFM для нужного сбора данных и используйте перчатки, этап монтажа чипа AFM, пинцет и небольшую отвертку, чтобы смонтировать чип в стеклянный блок.

Аккуратно поместите чип AFM на центр стеклянного блока. Кантилевер плюс очень небольшая часть чипа AFM должны быть в видимой, непрозрачной части стеклянного блока. Используйте отвертку, чтобы затянуть винт, пока чип плотно против стеклянного блока, и использовать объектив, чтобы проверить, что чип ориентирован правильно.

Когда чип был должным образом ориентирован, поместите стеклянный блок в голову AFM в надлежащей ориентации и заблокировать стеклянный блок на место. После обнаружения нижней части калибровки тарелки с помощью ярко-полевой микроскопии, используйте систему AFM и панель управления двигателем Stepper для перемещения кантилевера AFM 2000 микрон над образцом. Используя яркое освещение поля и панель управления двигателем Stepper, медленно опустите чип AFM на дно стеклянной тарелки шагами от 100 до 200 микрон, чтобы избежать сбоя наконечника AFM в чашку Петри.

Найдите ручные микрометры, которые контролируют X Y или в простом движении головы AFM на приборной платформе. По мере того, как тень от кантилевера AFM темнеет, а форма становится острее, используйте ручные микрометры для коррекции головки AFM и регулировки положения кантилевера AFM в поле зрения. В настоящее время, возможно, потребуется скорректировать таблицы осмотра.

Следите за тем, чтобы тень появлялась в представлении программного обеспечения микроскопа, что указывает на то, что наконечник AFM приближается к нижней части блюда. Продолжайте использовать небольшие шаги, чтобы снизить наконечник AFM, пока кончик в основном находится в фокусе. Когда лазер находится в положении, используйте лазерные циферблаты выравнивания, чтобы располагать лазер на задней стороне, где наконечник AFM находится на кантилевере.

Панель лазерного выравнивания должна отображать сумма сигнала больше нуля вольт. Перемещение лазера, небольшое расстояние во всех направлениях на кантилевере AFM, пока максимальная сумма сигнала не будет достигнута, оставаясь на кончике AFM. После того, как лазерное положение установлено, используйте ручным управлением отклонения циферблаты до нуля вертикальной и боковой отклонения.

Используйте вертикальные и боковое отклонения ручки для выравнивания детектора так, что цель по центру и нет вертикального или бокового отклонения наблюдается в лазерной панели выравнивания. Откройте окно калибровки и введите всю конкретную информацию экспериментов. Замените лазерный световой фильтр.

Перед калибровкой выключите источник света конфокального микроскопа и закройте корпус AFM, чтобы ослабить любой потенциальный шум, поступающий из комнаты света или вибраций. Нажмите кнопку калибровки, чтобы автоматически позволить системе откалибровать наконечник. Когда калибровка завершена, жесткость кантилевера и его чувствительность будут отображаться в панели калибровки.

Затем используйте кнопку Automated Approach Command, чтобы опустить наконечник в нижней части образца блюда и установить размер области кожи, разрешение, точку набора, длину и время пикселя, прежде чем нажать кнопку воспроизведения, чтобы начать сканирование. Для конфокального микроскопа изображения в микроскоп программного обеспечения, позволяют конфокальные возможности и выбрать лазерные линии, подходящие для красителей, которые были использованы для окрашивания образцов. Выберите одну или несколько лазерных линий, чтобы возбудить и издать эти функции в образце и установить выигрыш значение, которое оптимизирует флуоресценцию образца, но ограничивает количество шума.

Отрегулируйте мощность лазера, чтобы избежать насыщенных пикселей при максимизации динамического диапазона и установите размер пинхол в одну единицу области, чтобы максимизировать разрешение для оптического сечения. При необходимости отрегулируйте значения на основе яркости выборки. Чтобы установить время обитуемого пикселя, начните с двух микросекундного времени обитуемого времени и при необходимости отрегулируйте, чтобы отразить яркость выборки.

Чтобы выбрать размер пикселя для выбранной цели, позвольте прибору рассчитать размер пикселя с помощью кнопки опции Nyquist и выбранного количества пикселей на изображении. Далее выберите опцию сканирования и начните сбор данных. Используйте ручку фокусировки, чтобы найти фокусную плоскость, представляющую функции образцов в самой ясной форме, кнопку сканирования, чтобы начать сбор данных, и кнопку Захвата для захвата двумерного изображения.

Используя панель, которая контролирует размер пикселей с помощью опции Nyquist, уменьшите размер сканирования, чтобы охватить только одну ячейку. Активируйте инструмент сбора и используя опцию снизу вверх, только с лазерной линией, которая наиболее четко освещает функцию в образце, установите стартовые и финишные плоскости для объема, который будет измеряться с помощью предложенного интервала между плоскостями. Назовите файл и сохраните его в связанной папке.

Кроме того, если наши априори знания о толщине образцов существует, выберите самый яркий, острый, средний самолет, регулируя фокус, чтобы определить громкость и установить верхнюю, чтобы иметь толщину образца над средней плоскости, и дно, чтобы иметь толщину ниже средней плоскости, а затем выбрать соответствующий размер шага. Запустите приобретение, нажав кнопку Run Now. Когда приобретение завершится, сохраните файл в соответствующей папке.

В конце эксперимента надевайте перчатки при удалении стеклянного блока и поместите его в монтажную станцию. Используйте пинцет с резиновыми рукоятками, чтобы тщательно удалить чип AFM и поместить использованный наконечник обратно в расположение коробки хранения, ориентированной на доступ, чтобы обозначить, что он был использован. Для будущей справки обратите внимание, какой совет был использован в эксперименте.

Здесь показано репрезентативное сканирование AFM на живой ячейке HEK. Высота для этой конкретной ячейки HEK составила около 10 микрон, о чем свидетельствует сканирование линии. Здесь можно увидеть пример плохого сканирования из-за неправильного выбора чаевых AFM.

На этом изображении черные пиксели появились на вершине ячейки, что указывает на то, что зона AFM PA находится вне диапазона из-за большой высоты ячейки. Конец кантилевера AFM также отображается на изображении из-за смещения наконечника в сочетании с недостаточной высотой наконечника по сравнению с высотой ячейки. Эти артефакты на изображении AFM указывают на то, что для изображения ячейки должен был быть выбран другой наконечник AFM.

Три цветных конфокальных изображения могут быть выполнены. Например, визуализировать ядро клетки, микротубюли и липофильную мембрану. Анализ отступов наконечника в сочетании с наномеханической моделью позволяет создать модулированную карту поверхности.

Здесь показана соответствующая 3D проекция лазерного конфокального стека. AFM сканирует и измеряется модул карты также могут быть приобретены для микробов, как это наблюдается в этих репрезентативных анализ стрептококков мутан бактерии. Как было продемонстрировано, лучшее разрешение может быть достигнуто в этом масштабе с AFM, чем с традиционной конфокальные микроскопии.

Adhesive отображение силы является метод, выполняемый через conpokal для визуализации молекулярных взаимодействий. Например, для изучения модуляции молекул поверхности клеток для наблюдения за связывающей кинетикой. Conpokal открывает новый путь для изучения структуры функции отношений в медицинской микробиологии.

Например, физические и химические события и слой пептидогликан, могут быть связаны с устойчивостью к антибиотикам.