Оценка экспрессии основных гистосовместимости комплекс класса I на первичном Murine гиппокампа нейронов потока цитометрии

Этот протокол использует проточную цитометрию для количественной оценки внеклеточной экспрессии MHC класса 1 на первичных нейронах, культивируемых у мышей. Иммуноокрашивание NC2 для экспрессии MHC1 также может быть выполнено, чтобы избежать потери сигнала из-за белковых, третичных, структурных изменений, пермеабилизации или денатурации. В дополнение к направлению иммунных реакций на инфекции, MHC класса 1 модулирует нейронные синаптические связи.

Однако факторы, регулирующие экспрессию MHC класса 1, до сих пор неизвестны. Этапы вскрытия эмбрионального мозга требуют практики. Изучая технику, позаботьтесь о том, чтобы практиковать вскрытие, не беспокоясь о времени или последующем процессе культивирования.

Для выделения эмбрионального гиппокампа поместите первый собранный эмбриональный мозг мыши под стереодиссекционный микроскоп. И с помощью двух пар щипцов Sterile Dumont No 5 отщипнуть обонятельные луковицы и тщательно оттянуть мозговые оболочки. После того, как мозговые оболочки будут полностью удалены, верхняя сторона коры головного мозга откроется латерально, чтобы обнажить гиппокамп.

С помощью щипцов отщипните гиппокамп от прикрепленной коры головного мозга и осторожно перенесите изолированный гиппокамп в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров Hibernate-E Medium на льду. Когда все гиппокампы будут собраны в одну 15-миллилитровую пробирку, осадите мозговую ткань с помощью центрифугирования. Замените надосадочную жидкость на 0,5 миллилитра свежеприготовленной диссоциации папаина на каждый эмбрион и перемешайте пробирку несколько раз путем инверсии.

Поместите ткань при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, перемешивая образцы методом инверсии каждые 10 минут, прежде чем снова собрать ткань центрифугированием. Замените надосадочную жидкость равным объемом свежего Hibernate-E Medium и используйте полностью открытое стекло, отполированное пипеткой Пастера для растирания ткани 10 раз. Дав ткани отстояться в течение двух минут, переложите надосадочную жидкость в новую 50-миллилитровую коническую трубку.

Добавьте равное количество Hibernate-E Medium обратно в ткань и с помощью полуоткрытого стеклянного пипетки Пастера, отполированной огнем, растерите ткань 10 раз. Дав ткани отстояться еще две минуты, слейте надосадочную жидкость в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте равное количество Hibernate-E Medium к тканям и растирайте ткань 10 раз с помощью пипетки Пастера с открытой стеклянной полировкой.

Дав ткани отстояться в течение двух минут, слейте надосадочную жидкость в 50-миллилитровую пробирку. Соберите диссоциированные клетки в надосадочную жидкость методом центрифугирования. И ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах питательной среды для нейронов для подсчета, разбавьте клетки до конечной плотности покрытия в пять раз от 10 до пятой части жизнеспособных клеток на миллилитр питательной среды для нейронов и добавьте по одному миллилитру клеток в каждую лунку 12-луночного планшета, покрытого поли-D-лизином.

Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур, заменяя половину среды равным объемом свежей среды два раза в неделю в течение всего срока жизни культуры. Чтобы оценить способность культивируемых нейронов экспрессировать MHC1, в соответствующий день культивирования замените 0,5 мл надосадочной жидкости в каждой лунке на 0,5 мл свежей среды для роста нейронов с добавлением 200 единиц интерферона бета на миллилитр в течение 6-72-часовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур. В конце инкубации промойте каждую лунку один раз холодной нейробазальной средой без добавок перед добавлением 0,5 миллилитров неиспользованной холодной нейробазальной среды с добавлением одного микрограмма на миллилитр FC-блока и одного микрограмма на миллилитр флуоресцентного конъюгированного антитела к MHC1 в каждую лунку.

После 45-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия защитите его от света. Промойте каждую лунку один раз холодным Dulbeccos PBS. Затем добавьте в каждую лунку 0,5 миллилитра буфера для диссоциации клеток комнатной температуры, не содержащего ферментов, и перемешайте, чтобы вытеснить клетки.

Подтвердите диссоциацию под микроскопом инвертированной культуры тканей и добавьте по 0,5 мл буфера FACS в каждую лунку. Растирайте ячейки для диспергирования комков и переносите весь объем из каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 миллилитров. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах свежего буфера FACS на пробирку.

Перелейте каждую суспензию в отдельные лунки 96-луночной U-образной нижней пластины и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров фиксирующего реагента. Растирайте несколько раз, чтобы избежать слипания клеток, и инкубируйте планшет в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации центрифугой соберите клетки на дне лунок и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах свежего буфера FACS на лунку.

После центрифугирования гранулы ресуспендируют в 100 микролитрах реагента для пермеабилизации, дополненного флуоресцентным сопряженным антинейрональным антителом на лунку. После смешивания выдержать тарелку в течение 20 минут при комнатной температуре при укачивании в защищенном от света месте. В конце инкубации соберите клетки методом центрифугирования три раза, повторно суспендируя гранулы в 100 микролитрах свежего буфера FACS между центрифугированием.

После последней промывки ресуспендировать клетки в 100 микролитрах 2%-ной пары формальдегида в буфере FACS с тщательным перемешиванием. Нейроны могут быть идентифицированы с помощью последовательного стробирования общих событий для исключения клеточного мусора и дублетов, а также по положительным свойствам их нейронных ядер. Положительные клетки нейронных ядер затем могут быть дополнительно проанализированы на их MHC1-положительную способность.

На основании этих данных можно рассчитать процент нейронов, положительных на окрашивание MHC1, и медианную интенсивность флуоресценции, показав, что, например, лечение интерфероном бета значительно повышает процент и интенсивность экспрессии нейронов MHC1. С небольшими модификациями эти методы могут быть использованы для культивирования других нейронных популяций, таких как корковые нейроны, или для тестирования различных клеточных маркеров, стимулирующих молекул или генетических модификаций.