Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей

В дополнение к протоколу дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в нейронные клетки, мы также показываем ряд экспериментов, которые могут всесторонне проанализировать процесс дифференцировки. Эти методы имеют отношение к раннему эктодермальному эмбриональному развитию, предоставляя исследователям возможности для анализа дифференцировки нейронных клеток. При попытке проведения этой процедуры важно начать со стволовых клеток в оптимальном состоянии.

Следовательно, важно, чтобы БЭ, МПК и нейроны культивировались в свежих и оптимальных средах. Визуальная демонстрация этого протокола важна, потому что он содержит мельчайшие детали, которые могут повлиять на его успех и эффективность, особенно в части дифференциации. Начните с установки культуры висячих капельных клеток.

Для 10-сантиметрового планшета для культивирования клеток отрегулируйте концентрацию до 500 клеток на 20 микролитров дифференцировочной среды. Приготовьте достаточное количество клеточной суспензии на 50 капель по 20 микролитров. С помощью микропипетки или пипетки-репитера поместите капли клеточной суспензии объемом 20 микролитров на крышку планшета для культивирования тканей, следя за тем, чтобы капли не располагались слишком близко друг к другу, чтобы предотвратить их слияние.

Наполните тарелку пятью-10 миллилитрами PBS и осторожно закройте тарелку крышкой. Инкубируют культуру в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Через два дня соберите капли с крышки и поместите их в 10-сантиметровую суспензию клеточной культуры, заполненную 10 миллилитровыми дифференцировочными средами, затем поместите пластину на орбитальный шейкер, установленный на низкую скорость в инкубаторе.

Еще через два дня центрифугируйте клетки при 200-кратном G в течение трех минут, и удалите надосадочную жидкость. Чтобы индуцировать дифференцировку эмбриоидных тел в нейральные клетки-предшественники, повторно суспендируют клетки в дифференцировочной среде с пятимикролярной ретиноевой кислотой. Выдержите пластину в течение двух дней, затем замените меньшую половину среды свежей средой, наклонив пластину и отпив ее.

Соберите клетки через два дня, центрифугируя их при температуре 200 G в течение трех минут и удалив надосадочную жидкость. Зафиксировать эмбриоидные тельца и нервные клетки-предшественники с помощью 4% PFA в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем извлеките PFA и промойте клетки в PBS в течение пяти минут.

Инкубируйте клетки последовательно в PBS 10, 20 и 30% растворах сахарозы при температуре от 25 до 28 градусов Цельсия, при этом каждая инкубация длится 30 минут или дольше, пока клетки не осядут на дне пробирки. И используйте его для переноса образца в центр криоформы, пипетируя лишнюю жидкость. Осторожно добавьте в форму оптимальную температуру резки или раствор ОКТ, не суспендируя образец повторно, затем удалите лишние пузырьки с помощью пипетки.

Помещают форму с образцом на лабораторный миксер на низкой скорости на 15 минут, что позволит осесть эмбриоидные тельца и нервные клетки-предшественники на дно раствора ОКТ. Затем быстро заморозьте образец, поместив форму в жидкий азот. Заблокируйте секции ОКТ или культуральные камеры, содержащие нейроны в 10% нормальной ослиной сыворотки и 0,1% Triton X-100 в PBS в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем инкубируйте образцы в первичном антителе, разведенном в 5% нормальной ослиной сыворотке и 0,05% Triton X-100 в PBS, при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день промойте образцы в PBS с 0,1% Triton X-100 три раза по пять минут за промывку. Инкубируйте их со вторичными антителами, разведенными в 5% обычной ослиной сыворотке и 0,05% Triton X-100 в PBS, в течение одного часа при комнатной температуре.

Повторите промывки в Triton X-100 и PBS, затем инкубируйте образец в DAPI в соотношении один микрограмм на миллилитр. Закрепите образец с помощью покровного стекла и некоторого монтажного носителя, дайте ему высохнуть и сфотографируйте его с помощью флуоресцентного микроскопа. Для проведения дифференцировки нейронов клетки E14 культивировали на гамма-облученных эмбриональных фибробластах мышей до тех пор, пока популяция фибробластов не разбавлялась.

Плюрипотентность клеток Е14 была подтверждена окрашиванием щелочной фосфатазой. После дифференцировки тела эмбрионов имели круглую форму, которая постоянно увеличивалась в размерах. К 10-му дню нервные клетки-предшественники, дифференцировавшиеся в нейроны, имели удлиненную клеточную форму.

Эксперименты по иммунофлуоресценции были проведены на нейронных клетках-предшественниках на восьмой день и на нейронах на 12-й день. Положительное окрашивание наблюдалось для гнездования в нейральных клетках-предшественниках и для нейрофиламентов в нейронах. Линия эмбриональных стволовых клеток мыши, экспрессирующая репортер GFP, управляемый промотором Sox1, была дифференцирована, и была выполнена проточная цитометрия на эмбриональных стволовых клетках и нервных клетках-предшественниках.

Было обнаружено, что 58,7% от общего числа клеток на стадии NPC являются GFP-положительными, в то время как 0% GFP положительны на стадии ESC. Эксперименты по секвенированию РНК проводились на эмбриональных стволовых клетках E14, эмбриоидных тельцах и нервных клетках-предшественниках. Гены на тепловой карте последовательности РНК были отсортированы на основе уровня их экспрессии.

Онтологический анализ генов четырех кластеров генов показал, что они соответствуют различным клеточным функциям или путям. При выполнении этого протокола ЭБС должна проявляться в виде сферических, почерневших масс клеток. Чтобы убедиться, что EBS растет с такими растениями, меняйте среду в первый же день, если она начинает приобретать желтоватый оттенок.

Тот же подход важен и для культуры ПДК, поскольку как БЭ, так и МПК находятся на критической стадии раннего эмбрионального развития. Другие функциональные геномные анализы, такие как ChIPseek и анализы подтверждения хроматина на различных стадиях дифференцировки нейронов, могут быть выполнены для понимания основных биологических процессов. Интеграция химических и функциональных геномных анализов в процесс дифференцировки нейронов позволяет исследователям лучше определить молекулярные механизмы раннего эмбрионального развития.