Культура и анализ крупномасштабных смешанных популяций Caenorhabditis elegans

Этот метод позволяет нам собирать крупномасштабные популяции червей для использования на нескольких платформах омики с минимальными манипуляциями. Этот метод позволяет нам собирать смешанные популяции C.elegans в нескольких экспериментах по омике для получения целостной картины каждого образца. Для точечного отбеливания взрослых особей на крупномасштабных культуральных пластинах подожгите червячный ковыр над горелкой Бунзена и используйте кирку, чтобы зачерпнуть свежую E.coli с края бактериального газона на крупномасштабную культуральную пластину.

Выберите одну взрослую особь из четвертого куска пластины для точечного отбеливания и добавьте пять микролитров свежеприготовленного щелочного раствора гипохлорита в один угол крупномасштабной культурной пластины вдали от газона E.coli. Поместите взрослую особь в щелочной раствор гипохлорита и постучите по нематоде, чтобы нарушить кутикулу и выпустить яйца. Когда в общей сложности пять взрослых особей будут равномерно размещены вокруг газона E.coli таким же образом, поместите крышку обратно на тарелку.

Чтобы собрать образцы с крупномасштабных культурологических пластин, налейте 50 миллилитров раствора M9 на одну крупномасштабную поверхность культурального листа и закрутите пластину, чтобы гарантировать, что M9 покрывает всю поверхность агарозы среды роста нематоды. Загрунтуйте стерильную серологическую пипетку M9 и наклоните пластину так, чтобы популяция M9 и червей собралась в одном углу пластины. Используйте загрунтовочную пипетку, чтобы аспирировать суспензию червя и добавить червей в коническую трубку размером 50 миллилитров.

Поместите трубку на коромысло, чтобы разрушить любые бактериальные скопления и мусор. Когда все черви будут собраны со всех трех пластин, переложите 15 миллилитров червей из каждой трубки в каждую из трех конических трубок по 15 миллилитров и осадите червей в трубках путем центрифугирования. Осторожно аспирировать супернатанты, не нарушая гранул червя, и добавить в каждый тюбик по 13 миллилитров червячной суспензии.

Перевернуть трубки, чтобы повторно суспендировать гранулы и смыть как можно больше бактерий и мусора и снова центрифугировать червей. Когда каждая популяция червей будет собрана, промыть гранулы червя три раза в 10 миллилитрах свежего раствора M9 за промывку. После последней промывки повторно суспендировать каждую очищенную червячную гранулу в 10 миллилитрах двойной дистиллированной воды.

Для оценки размера популяции быстро разбавляют три 100 микролитровых аликвоты образца червя из каждой пробирки в 900 микролитрах раствора М9 на образец и используют аликвоты для серийного разведения. Поместите суспензии образцов штоковых червей на коромысло для непрерывного перемещения культур во время подсчета аликвот и перемешайте разбавления червей до тех пор, пока они не будут однородными. Добавьте пять микролитров раствора от первого до 10 образцов червей на слайд стеклянного микроскопа и подсчитайте червей с помощью световой микроскопии.

Если в образце менее 50 червей, подсчитайте разведения 1:100 и 1:1 000. Если червей более 50, переходите к следующему серийному разведению. После подсчета каждой аликвоты, реплицированной каждого разбавления три раза, усредняйте количество разбавления, чтобы определить предполагаемый размер популяции червя.

Затем разбиение образцов червей на соответствующие экспериментальные аликвоты и мгновенно замораживают образцы в жидком азоте для хранения при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы подготовить образец червя для цитометрии потока крупных частиц, разбавляют примерно в пять раз от 10 до четвертой смешанной стадии червячной аликвоты до конечного объема 10 миллилитров раствора M9 и добавляют 200 микролитров одного миллиграмма на миллилитр E.coli и 1:50 разбавление 0,5 микромолярной красной флуоресцентной микросферы раствора червя. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре с раскачиванием соберите червей и микросферы центрифугированием и дважды промывайте червей свежим раствором М9, чтобы удалить лишние бактерии и неинтернализованные микросферы.

После второй промывки повторно суспендируют гранулу в пяти миллилитрах раствора М9. Если гранула выглядит чистой, добавьте пять миллилитров M9, дополненных 50 миллимолярным азидом натрия, к червям и поместите трубку на коромысло, чтобы выпрямить и усыпить червей для точного подсчета и определения размера. Для документации по распределению популяции откройте калиброванный шаблон пластины на 384 скважины и установите шаблон для распределения 20 закрытых объектов в четыре скважины, чтобы получить четыре технические копии каждой закрытой области для каждой из 20 бар областей образца.

Загрузите 40-миллилитровый образец червей на цитометр потока крупных частиц и начните автоматическую сортировку образца, непрерывно перемешивая образец, чтобы предотвратить осаждение и одновременное дозирование объектов из образца в калиброванную пластину с 384 скважинами. После того, как весь образец был отсортирован и максимальное количество закрытых областей было распределено в пластину с 384 скважинами, извлеките образец из цитометра и очистите инструмент. Крупномасштабный метод культивирования пластин был протестирован на 15 штаммах C.Elegans, включая смесь мутантов Caenorhabditis Genetics Center и диких штаммов Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource.

В этом анализе крупномасштабный метод культуры пластины дал размеры популяции от примерно 94 500 до 9 290 000. Средний размер популяции в пределах эталонного штамма PD1074 и среди штаммов составил примерно 2,4 миллиона червей. Не было обнаружено существенных различий в предполагаемых размерах популяции между штаммами C.elegans в течение в среднем 12,2 крупномасштабных дней роста культуры.

Крупномасштабным культурным пластинам PD1074 потребовалось от 10 до 14 дней, чтобы вырасти до полной смешанной популяции со средним временем роста 12,2 дня. Самый медленно растущий штамм рос максимум 20 дней, а самый быстрорастущий штамм рос минимум 10 дней. В этом распределении образцов для PD1074 черви были измерены от стадии L1 через гравидную взрослую особь на цитометре с большим потоком частиц.

Последующая визуализация и визуализация вариаций в распределении популяции по образцам показали, что конвейер генерирует смешанную популяцию C.elegans. Важно точно подсчитывать червей на протяжении всего сбора образцов, чтобы получить данные, сопоставимые по наросткам и исследованиям. Этот подход к сбору может быть применен к секвенированию РНК, геномике и другому анализу омики, чтобы расширить наше понимание сложной динамики, которая происходит в популяциях C.elegans.

Этот метод позволяет нам собирать смешанные популяции C.elegans в нескольких экспериментах по омике для получения целостной картины каждого образца.