Один клеточный диссоциативный подход для молекулярного анализа мочевого пузыря в мыши после травмы спинного мозга

Этот протокол имеет большое значение, поскольку он использует биологическую информацию для облегчения создания одиночной клеточной суспензии с высокой жизнеспособностью клеток. Основным преимуществом этого метода является возможность получения суспензий одиночных клеток, которые сохраняют высокую жизнеспособность клеток и соответствующее представление выделенных типов клеток. Демонстрировать хирургическую процедуру будет Хусейн Атта, научный сотрудник моей лаборатории.

Демонстрировать процедуру диссоциации тканей будет Али Хашеми, а анализ FACS — Ясер Хешмати. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс у взрослой мыши, находящейся под наркозом, пальпируют наиболее заметный остистый отросток в грудном отделе позвоночника. Перед операцией назначают анальгезию и антибиотики.

Выбрейте продольный прямоугольник на тыльной стороне мыши от нижней части горловины до чуть ниже самого выступающего остистого отростка и по одному сантиметру с каждой стороны от средней линии. Продезинфицируйте открытые участки кожи три раза последовательными салфетками с 10% повидон-йодом и 70% этанолом по кругу, начиная от места разреза и двигаясь к краям. После последнего протирания накройте мышь стерильным куском марлевой губки размером четыре на четыре дюйма с окном над операционным полем.

Чтобы вызвать травму спинного мозга, сначала сделайте 1,5-сантиметровый разрез в середине спины и используйте острое тупое рассечение, чтобы отделить мышцы от остистых отростков и пластинок позвонков Т9, Т10 и Т11. С помощью тонких ножниц резко разделите межостистые связки между Т9 и Т10 и Т10 и Т11 перед выполнением двусторонней ламинэктомии остистого отростка Т10. Когда пластинки будут полностью иссечены, с помощью ножниц пересеките спинной мозг.

Чтобы полностью срезать боковые столбики, аккуратно проведите кончиком тонких ножниц с обеих сторон. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы сжать кровотечение. После достижения гомеостаза закрыть кожу непрерывными швами 7-0 полиглактин910 и подкожно ввести один миллилитр солевого раствора для предотвращения послеоперационного обезвоживания, затем вернуть животное в свежую клетку с контролем до полного лежачего состояния.

Каждые 12 часов, держа животное одной рукой и массируя нижнюю часть живота другой, указательным и большим пальцами находите и мягко сжимайте растянутый мочевой пузырь, чтобы стимулировать ручное сцеживание мочевого пузыря до тех пор, пока животное не сможет мочиться самостоятельно. Для последующего анализа интересующих типов клеток мочевого пузыря, в соответствующий момент эксперимента и после того, как животное будет адекватно обезболино, выполните лапаротомию по средней линии от таза к диафрагме и отрежьте диафрагму от ребер. Следуя по границе костного хряща, параллельной грудине, вскройте грудную клетку вдоль ребер с обеих сторон животного, начиная от диафрагмы и продолжая к первому ребру.

После фиксации передней грудной стенки над головой животного с помощью тонких ножниц отрежьте перикард и подсоедините иглу 23 калибра к перфузионному аппарату. Введите иглу в левый желудочек и медленно продвигайте иглу в аорту, не прокалывая ткань. Когда игла будет на месте, начните вводить в ткань PBS со скоростью потока 15 миллилитров в минуту и с помощью кончиков тонких ножниц быстро сделайте небольшой надрез в правом предсердии.

Когда дренаж станет прозрачным и можно будет наблюдать осветление цвета печени, остановите перфузию и освободите мочевой пузырь от сосудистых ножек и уретры, затем поместите мочевой пузырь в микроцентрифужную пробирку, содержащую ледяной раствор Tyrode. Чтобы приготовить одноклеточную суспензию, когда все пузыри будут собраны, разорвите микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, содержащую 100 микролитров раствора Тирода. После взвешивания измельчите мочевые пузыри в 10-сантиметровой чашке Петри, содержащей 100 микролитров раствора Тироде, и с помощью наконечника пипетки с широким отверстием переведите фрагменты ткани в 2,5 миллилитра буфера для пищеварения на мочевой пузырь.

Инкубируйте ткань в течение 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия на миксере Nutator и используйте пипетку объемом пять миллилитров для растирания образца в течение одной минуты, прежде чем собрать диссоциированные клетки и ткани путем центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре раствора для отделения клеток и поместите клетки на смеситель Nutator еще на 10 минут. В конце инкубации соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов.

Через одну минуту прекращают лизис с добавлением девяти миллилитров PBS и фильтруют клетки через сетчатое фильтр 70 мкм в пробирку объемом 50 мкл, затем снова центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулу в 200 мкл окрашивающего буфера с добавлением FC-блока. После 10-минутной инкубации на льду соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме флуорофорной конъюгированной смеси антител в течение 20 минут на лед, защищенный от света. В конце инкубации промойте клетки одним миллилитром буфера для окрашивания клеток и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах свежего буфера для окрашивания клеток с добавлением пяти микролитров FITC Annexin V и одного микролитра йодида пропидия.

Через 15 минут при комнатной температуре добавьте в ячейки 400 микролитров связывающего буфера Аннексин и перемешайте путем инверсии. Чтобы проанализировать клетки с помощью проточной цитометрии, сначала используйте образец неокрашенной клетки, чтобы задать параметры бокового и прямого рассеяния клеток, затем измерьте флуоресцентное излучение на 530 нанометрах и более 575 нанометров, чтобы исключить мертвые клетки. Используйте сетки на каждом точечном блоте, чтобы определить отрицательное население в первом распаде, и используйте контроль флуоресценции минус один для коррекции спектрального перекрытия до тех пор, пока отрицательная и положительная среды популяции не будут выровнены.

Затем измерьте 100 000 событий клеток с помощью специфических маркеров, представляющих интерес, создавая вентили для представляющих интерес популяций клеток, если это необходимо. Когда все образцы будут обработаны, проанализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для проточного цитометрического анализа. Коллаген 1А1, коллаген 3А1, коллаген 1А2 и коллаген 6А1 являются наиболее распространенными типами коллагена, обнаруженными в пузыре мышей.

Анализ для определения уровней экспрессии мРНК коллагенов 1, 3, 6 и гиалуронана показывает, что экспрессия этих компонентов внеклеточного матрикса более распространена в популяциях мезенхимальных клеток, чем в уротелии. Проточный цитометрический анализ показывает, что несколько различных протоколов ферментативного расщепления позволяют получить высокожизнеспособные клеточные популяции, причем третий протокол расщепления, использованный в этом анализе, определен как наиболее эффективный для сохранения клеток. С помощью этого метода можно получить значительное увеличение общего количества клеток, выделенных из мочевого пузыря мышей с травмой спинного мозга, для сравнения с контрольными мочевыми пузырями.

По сравнению с контрольной группой, мочевые пузыри животных с травмой спинного мозга также демонстрируют значительное увеличение CD45-положительных клеток. Шаг 7.1 важен для выявления в кардиологической популяции. Стратегия стробирования должна основываться на интересующих вас клетках.

Мочевые пузыри животных с ТСМ имеют различную клеточную популяцию. Этот протокол может быть использован для сортировки клеток, первичной клеточной культуры, секвенирования одиночных клеток и других молекулярных и клеточных последующих процедур, требующих жизнеспособных одиночных клеток. Этот протокол обеспечивает высокую жизнеспособность и, следовательно, низкую потерю популяции клеток, что является ключевым моментом для методов анализа одиночных клеток, таких как секвенирование РНК одиночных клеток.