Количественная оценка зоны сцепления cell-substrate и распределения формы клеток в монолиях клеток MCF7
24 июня 2020 г.
В статье описывается количественная оценка 1) размера и количества фокусных спаек и 2) индекса формы клеток и его распределения от конфокальных изображений слияние моноселей клеток MCF7.
Этот протокол позволяет количественно оценить площадь, периметр и форму внутриклеточной структуры по двумерным изображениям. Этот метод быстр и прост, требует только стандартных лабораторных настроек и конфокального микроскопа и использует программное обеспечение с открытым исходным кодом. Демонстрацией процедуры будет Анна Бальцерак, аспирантка из моей лаборатории.
Начните с посева четыре раза от 10 до пятой клетки в 0,5 миллилитров культуры среды на колодец в четыре хорошо коллагена одной покрытием камеры слайд для 24-часовой культуры в 37 градусов по Цельсию и пять градусов углекислого газа инкубатора. На следующее утро используйте оптический перевернутый микроскоп, чтобы проверить наличие по крайней мере 90%-ного слияния монослой и использовать конфокальный микроскоп для получения одного изображения с ломтиками. Для анализа фокусного адгезии откройте изображения в ImageJ и выберите анализ, установите масштаб, удалите масштаб и глобальную, чтобы установить шкалу изображения в пикселях.
Чтобы включить имя файла и область области, представляющие интерес в вариантах измерения, нажмите проанализировать и установить измерения и проверить область и параметры отображения этикетки. Чтобы вычесть фон, выберите процесс и вычесть фон. Установите радиус подвижного шара до 50 пикселей и проверьте раздвижной параболоид.
Чтобы определить область самой маленькой области интереса, наметьте малейшее фокусное деление и нажмите на анализ и меру для измерения области. Когда было отобрано и измерено по крайней мере 20 областей, представляющих интерес, рассчитать и сохранить среднее количество полученных результатов. Установите верхнюю границу до 25% типичной области ячейки.
Чтобы присвоить изображение двоичному, нажмите на изображение, отрегулируйте и порог, и проверьте по умолчанию, черно-белый и темный фон. Для измерения количества и областей областей, представляющих интерес, выберите анализ и анализ частиц и проверьте пиксельные единицы, отобразить результаты, четкие результаты и обобщить. Перенесите данные о срезе, подсчете и общей площади среднего размера из сводного окна в программу управления данными по выбору.
Для количественной оценки фокусного адгезии откройте макрос фокусного адгезии ImageJ и введите область самой маленькой области интереса в качестве области малейшего параметра, представляющих интерес. Установите значение порогового типа для ручного или автоматического и сохраните изменения. Затем позвоните макросу из ImageJ и выберите изображение для обработки.
Для ручного анализа формы ячейки откройте изображение в соответствующей программе обработки изображений и выберите параметры, которые будут измерены. Используйте инструмент выбора от руки, чтобы вручную разграничить границы клеток, отмеченные белками соединения выбора. Выбранные параметры будут автоматически рассчитаны для каждой ячейки.
Когда все ячейки будут изложены, выберите редактировать, выбирать и добавлять в менеджер. Следует выбрать только полностью видимые ячейки с непрерывными границами. Чтобы сделать измерение, отметьте все числа, появляющиеся в левой коробке области менеджера интересов, и нажмите меру.
Результаты будут отображаться в поле результатов и могут быть импортированы в электронную таблицу по выбору. Автоматизированный анализ клеток облегчает количественную оценку большого количества клеток. Для каждого нового типа ячейки сначала запустите макрос для установления параметров.
Когда макрос закончится, выберите границы размера ячейки. Нажмите на этикетку самых маленьких и крупнейших ячеек и нажмите меру. Установите значение самой маленькой ячейки и крупнейших переменных ячееок и сохраните изменения.
Закройте все макро окна и выберите изображение, которое будет обработано в серой шкале. Затем запустите макрос снова. Макрос предоставит таблицу результатов, которая включает индекс формы ячейки, соотношение аспектов и данные списка выбора интересов.
Здесь можно наблюдать репрезентативные изображения фокусных спайков, подсчитанных с Помощью ImageJ, включая окончательные проумерено очертания и наложения контуров фокусной адгезии с исходным изображением как для линий управления, так и для нокдауна. Как показано в этом анализе, нокдаун клетки продемонстрировали большее количество спаек на клетку, а также спайки, которые больше по размеру по сравнению с клетками линии управления. На этих снимках показаны репрезентативные области необработанных и химиотерапевтически обработанных клеточных монослой.
Клетки контура были охарактеризованы в соответствии с их значениями индекса формы клеток, например, в этом анализе, показывающем увеличение последнего ящика и выравнивание основных пиков для обработанных наркотиками клеток по сравнению с необработанными контролями. Затем для каждой клеточной культуры можно было бы сгенерировано распределение частот и кумулятивное распределение. Серомасштабная визуализация монослоев, как было продемонстрировано, позволила провести анализ и количественную оценку 512 ячеек из 12 областей зрения, показывая относительное распределение частоты индекса формы клетки.
Для работы этого протокола важно использовать изображения наилучшего качества. Правильное посев клеток, окрашивание и визуализация должны обеспечивать достаточное экспериментальное качество изображений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье описан протокол для количественного определения фокальных адгезий и индекса формы клеток в конфлуэнтных моно-слоях клеток MCF7 с использованием конфокальной визуализации. Исследование подчеркивает, как можно анализировать изменения в адгезии и форме клеток с помощью доступных методов визуализации.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Анализ фокальных адгезий
- Количественная оценка формы клеток
Фон
- Фокальные адгезии имеют критическое значение для адгезии клеток и сигнализации.
- Понимание формы клеток и их адгезии может повлиять на исследования биологии рака.
- Клетки MCF7 служат модельной системой для исследований рака молочной железы.
Используемые методы
- Конфокальная микроскопия для визуализации клеточных структур.
- Программное обеспечение ImageJ для анализа областей фокальных адгезий и индекса формы клеток.
- Ручные и автоматизированные протоколы анализа для эффективного сбора данных.
Основные результаты
- В клетках с подавлением экспрессии белка наблюдалось большее количество и больше размеры фокальных адгезий по сравнению с контрольными образцами.
- Были отмечены расхождения в индексе формы клеток между необработанными и обработанными лекарством клетками.
- Надежные методологии позволили анализировать большие выборки, повышая статистическую значимость.
Выводы
- Это исследование предоставляет надежный протокол для анализа морфологии клеток и свойств адгезии.
- Результаты способствуют пониманию механических свойств клеток, имеющих значение для исследований и разработок в области онкологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
