Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

Обнаружение фитопатогенов является важным шагом в управлении болезнями растений. Этот протокол обеспечивает метод быстрого обнаружения загрязнения оросительных вод из-за общего патогена истребителя, передающихся через воду. Используя этот метод, специфический патоген, такой как phytophthora capcici, может быть обработан и быстро обнаружен из нашего большого объема оросительной воды, оставаясь на месте.

Демонстрация процедуры будет Оуэн Хадсон, студент мастеров из моей лаборатории, и Sumyya Waliullah, постдокторант исследователь из лаборатории Dr.Pingxi G, чтобы создать насос и фильтр для на месте Phytophthora capcici обнаружения в оросительной воде. Прикрепите фильтровальную колбу к трубке, подключенной к ручной насосу, и прикрепите воронку бухнера в резиновую пробку во рту фильтруя колбы. Затем поместить соответствующий размер кусок фильтровальной бумаги с 15 микрон удержания размера в воронку.

Для получения проб воды собирают оросительную воду из целевого источника. Вода может иметь небольшое количество мусора, но не значительные осадки или почвы. Медленно залить от 50 до 1000 миллилитров испытательной воды над фильтровальной бумагой внутри воронки при использовании ручного насоса для создания всасывания тянуть воду через воронку.

Когда вся вода была отфильтровата, используйте типсы, чтобы удалить фильтровальную бумагу из воронки. И использовать стерильные ножницы, чтобы разрезать бумагу на мелкие кусочки. Погрузите от восьми до 12 кусков бумаги в 400 микролитров буфера извлечения в 1,5 миллилитровую трубку в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре.

Vortex или иным образом агитировать бумагу в течение 10 секунд раз в минуту. В конце инкубации используйте типсы, чтобы удалить бумагу с как можно меньшего буфера. И повторите лицензию со следующим набором фильтровальной бумаги штук.

Для извлечения ДНК из образцов фильтровальной бумаги добавлено 20 микролитров протеиназы K и 10 микролитров по 10 нанограмм на микролитер РНК в образец тоже и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 15 минут с вихрем или тряской каждые три минуты. В конце инкубации добавьте 500 микролитров магнитных бусин в буфер связывания с образцом и хорошо перемешайте, встряхивая. После пяти минут при комнатной температуре, поместите трубку и магнитный сепаратор стойку в течение двух минут, прежде чем удалить и отказаться от супернатанта.

Снимите трубку с магнитного сепаратора и энергично повторно приостановите бисер в 500 микролитров буфера стирки. Через 30 секунд вернуть трубку к магниту и подождать две минуты, прежде чем отказаться от супернатанта. Повторите стирку с 500 микролитров мыть буфера тоже и 500 микролитров 80% этанола, как только что продемонстрировали.

И воздух диск магнитных гранул шарика в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации повторно приостановить бисер в 50 микролитров элеватора элюционного буфера с пипеткой в течение одной минуты, прежде чем поместить трубку обратно на магнит в течение двух минут, чтобы сбор супернатанта. После подготовки смеси LAMP грунтовки, как указано в таблице, добавить на 2,5 микролитров грунтовки смесь 12,5 микролитров лавы LAMP mastermix один микролитр извлеченной ДНК и девять микролитров двойной дистиллированной воды в трубку ПЦР и создать один положительный и один отрицательный контроль.

инкубировать все образцы в 64 градусов по Цельсию тепла блог в течение 45 минут или джинна три инструмента усиления в конце инкубации, нагрузка из пяти микролитров каждого усиленный образец на 1%agarose гель и изображение в результате полосы на ультрафиолетовой машины изображения. Если был использован калорийный краситель, просмотрите изменение цвета, чтобы определить результаты как положительные или отрицательные. Если использовался портативный инструмент усиления, просмотрите график усиления на экране, чтобы определить результаты.

Оптическое время для запуска анализа LAMP при 64 градусах составляет 45 минут, так как самые низкие концентрации, которые были положительными для обнаружения, не усиливаются до 40 минут, в то время как более высокие концентрации усиливаются на 20 минут. Усиление может быть подтверждено на 1%agarose гель помечены нуклеиновой кислоты пятно. Как показано на примере обычных ПЦР в 40 раз менее чувствительны, чем LAMP.

Обнаружение 4,8 раза от 10 до третьего зооспора на миллилитр концентрации на самом низком уровне. В ходе этого анализа были взяты пробы воды из семи прудов, используемых для коммерческого производства овощей в округе Тифт, штат Джорджия. Три из которых продемонстрировали положительные результаты LAMP.

Однако, когда образцы были протестированы обычным пЦР, зооспоры были обнаружены только в одном из трех положительных образцов. В этой таблице суммируются различия между методами обнаружения с использованием таких переменных, как чувствительность, время, необходимая подготовка, материалы и стоимость. LAMP является наименее дорогим методом среди проверенных методов, а также является самым быстрым, требуя всего от 30 до 60 минут для усиления по сравнению с обычным усилением ПЦР.

Использование этого протокола ДНК, извлеченной из тесно связанных патогенов семян UMI, не приводит ни к обнаружению ни одного из образцов, подтверждая специфичность грунтовок. Убедитесь в том, чтобы не залить образец воды слишком быстро и быть осторожным при добавлении извлеченной ДНК в трубы LAMP, чтобы ограничить загрязнение. После того, как другие патогенные микроорганизмы, передающихся через воду, разработали свои специфические наборы грунтовки, методы фильтрации и ламповой кислоты могут быть адаптированы для других патогенных микроорганизмов.