Кислород-индуцированной ретинопатии Модель ишемической болезни сетчатки у грызунов

Кислород-индуцированной ретинопатии (OIR) может быть использован для моделирования ишемических заболеваний сетчатки, таких как ретинопатия недоношенных и пролиферативной диабетической ретинопатии и служить в качестве модели для доказательства концепции исследований в оценке антиангиогенных препаратов для неоваскулярных заболеваний. OIR вызывает надежную и воспроизводимую неоваскуляризацию сетчатки, которую можно количественно оценить.

После своей разработки модель кислород-индуцированной ретинопатии стала широко использоваться в доклинических исследованиях неоваскулярных заболеваний сетчатки. Он был использован в качестве модели для изучения патологического ангиогенеза в ответ на гипоксию. Основное преимущество этой модели заключается в том, что она индуцирует устойчивый нейроваскулярный ответ, который воспроизводим и легко поддается количественной оценке.

Эта модель может быть использована в качестве доклинической модели для изучения эффектов возможных терапевтических кандидатов. Он рассматривается в качестве актуальной модели для нескольких заболеваний человека, таких как ретинопатия недоношенных, диабетическая ретинопатия и влажная возрастная макулярная дегенерация. Запишите вес животных до и после индукции гипоксии, а также во время жертвоприношения.

Убедитесь, что на дне клетки достаточно корма и добавьте на дно камеры натронную известь с цветовым индикатором для поглощения излишков углекислого газа, когда система фильтрации не используется. Следите за влажностью и температурой внутри камеры, поддерживая влажность в диапазоне от 40 до 65%. При необходимости увеличьте влажность камеры, поставив на дно посуду с водой. Откалибруйте датчик кислорода с обычным комнатным воздухом и 100% кислородом.

Затем поместите мышей P7 в камеру и установите уровень кислорода на уровне 75%. Держите мышей в камере в течение пяти дней до P12, наблюдая за животными во время индукции. Когда закончите, удалите мышей из камеры. Взвесьте животных и сделайте опознавательные знаки на хвосте или ухе.

После того, как животное будет обезболито, выполните прищипывание пальцев ног. Допустим небольшой рефлекс. Во время лечения держите животное на грелке.

Используйте стеклянный шприц с иглой 33–34 калибра для инъекции IVT. Нанесите каплю йода, затем прижмите веко вниз и захватите глазное яблоко щипцами. Делайте инъекцию сзади лимбуса, примерно под углом 45 градусов, направленным в сторону зрительного нерва.

Удерживайте иглу на месте в течение 30 секунд после введения препарата, чтобы избежать рефлюкса введенного раствора. Осмотрите глаз на предмет осложнений, таких как кровоизлияния или повреждение сетчатки после удаления иглы. Нанесите мазь с антибиотиком на верхнюю часть глаза после инъекции.

При желании проведите визуализацию in vivo на живых животных в течение периода наблюдения, чтобы зафиксировать изменения, которые развиваются в сетчатке во время ангиогенных реакций. Используйте спектральную оптическую когерентную томографию для визуализации слоев сетчатки in vivo. Соберите глаза животных, разрезав ткань вокруг глаза, захватив за глазное яблоко изогнутыми щипцами и подняв глаз из орбиты.

Инкубируйте глазные яблоки в свежеприготовленном фильтрованном 4% параформальдегиде в течение одного-четырех часов. Снимите фиксатор и трижды промойте глазные яблоки PBS в течение 10 минут за промывку. Немедленно препарируйте сетчатку глаза или сохраните ее в PBS при температуре четыре градуса Цельсия.

Подготовьте плоские крепления сетчатки для количественной оценки объема неоваскуляризации и размера аваскулярных участков или AVA. Препарируйте сетчатку под стереомикроскопом с помощью микроножниц и щипцов. Поместите глазное яблоко в PBS, чтобы оно оставалось влажным, и проколите его в лимбе иглой 23 калибра, затем разрежьте вокруг лимба изогнутыми микроножницами, чтобы удалить радужную оболочку и роговицу.

Осторожно поместите кончик ножниц между РПЭ и нервной сетчаткой и разрежьте комплекс склеры сосудистой оболочки РПЭ по направлению к зрительному нерву. Проделайте то же самое с другой стороной глазного яблока. Затем аккуратно разрежьте или разорвите ткань до тех пор, пока чашечка сетчатки не обнажится.

Вытащите линзу из чашечки сетчатки и добавьте в чашку PBS. Удалите все гиалоидные сосуды, стекловидное тело и мусор, не повреждая сетчатку. Сделайте четыре разреза сетчатки прямыми микроножницами, чтобы создать структуру, похожую на цветок.

Используйте мягкую кисть или переводную пипетку, чтобы перенести его на пластину лунки для окрашивания. Пометьте сосудистую сеть сетчатки изолектином В4, который окрашивает поверхность эндотелиальных клеток. Инкубируйте сетчатку в блокирующем буфере в течение одного часа и промойте ее 1%-ным NGS и 0,1%-ным тритоном в TBS в течение 10 минут.

Инкубируйте сетчатку с помощью флуоресцентного красителя от 5 до 10 микрограммов на миллилитр конъюгированного изолектина B4 в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в защищенном от света месте. На следующий день трижды промойте сетчатку 1%NGS и 0,1%Triton в TBS в течение 10 минут за промывку. Поместите сетчатку на микроскоп предметным стеклом внутрь сетчатки вверх.

Затем осторожно расправьте сетчатку с помощью мягкой кисти и удалите все оставшиеся гиалоидные сосуды или мусор. Добавьте монтажный материал поверх образца и поместите покровное стекло поверх предметного стекла. Храните сетчатку при температуре четыре градуса Цельсия в защищенном от света месте.

Визуализируйте плоские крепления сетчатки с помощью флуоресцентного микроскопа с 10-кратным объективом. Сосредоточьтесь на поверхностном сосудистом сплетении и преретинальной неоваскуляризации. Сделайте изображение сканирования плитки, чтобы захватить всю сетчатку глаза и объединить сканы плитки.

Количественно оцените изображения путем измерения AVA, площади неоваскуляризации и общей площади сетчатки с помощью программы обработки изображений. Нарисуйте АВА и общую площадь сетчатки с помощью инструмента для рисования от руки и выделите неоваскулярные области с помощью инструмента выделения. В модели мышиной ретинопатии, вызванной кислородом, вазооблитерация происходит в центральной части сетчатки.

В то время как в модели крысы он развивается на периферии подобно человеческой РН. Преретинальная неоваскуляризация развивается вблизи аваскулярных областей, в частности центральной сетчатки у мышей и периферии у крыс. Гистологический анализ с использованием поперечных сечений или плоских креплений может быть проведен для оценки морфологических изменений в сетчатке OIR или наличия представляющих интерес типов клеток, например, воспалительных клеток.

По желанию, неинвазивная визуализация in vivo может быть проведена в течение периода наблюдения OIR. Сетчатка и гиалоидная сосудистая сеть могут быть визуализированы с помощью флуоресцеиновой ангиографии, а для оценки структурных изменений сетчатки может быть использована оптическая когерентная томография в спектральной области. Функциональные изменения можно измерить с помощью электроретинографии.

Афлиберцепт, растворимый VEGF-Trap, ингибирует как неоваскулярную, так и физиологическую реваскуляризацию при ОИР. Глаза, получившие ОИР в P14 с высокой дозой афлиберцепта, имели еще большие АВА сетчатки, чем необработанные глаза, что позволяет предположить, что афлиберцепт также блокирует физиологическую реваскуляризацию сетчатки, вызванную гипоксией. Применяя этот протокол, не забудьте заранее продумать правильный размер помета для вашего эксперимента и следить за самочувствием матерей и щенков в кислородной камере.

Учтите, что постнатальная прибавка в весе влияет на исход в модели. Образцы сетчатки, полученные с помощью этой модели, могут быть использованы для аналитических методов, таких как иммуногистохимия, анализ экспрессии генов или белков, а также для измерения эффектов потенциальных терапевтических кандидатов на сетчатку на молекулярном уровне.