Методы иммуногистохимии для анализа клеточной пролиферации и нейрогенеза у крыс с использованием аналога тимидина BrdU

Это ключевой протокол в области нейрогенеза у взрослых. Здесь мы представляем подробное описание шагов, необходимых для достижения успешного окрашивания. Эта методика позволяет одновременно идентифицировать специфические белки, совместно экспрессируемые в делящихся клетках, сохраняя при этом целостность тканей.

Мы рекомендуем заранее проверить антитела к тканям и состояния. Важнейшими этапами являются пермеабилизация мембраны, тщательная денатурация ДНК и тестирование времени на этапах блокировки и промывания. Стандартизация метода является сложной задачей для новых лабораторий.

Для введения аналога тимидина BrdU необходимо обездвижить нижнюю часть брюшной полости, чтобы удержать экспериментальную крысу, и с помощью одномиллилитрового шприца, оснащенного иглой 23 калибра, внутрибрюшинно ввести животному свежеприготовленный раствор BrdU в дозе 50 мг на килограмм. В соответствующей экспериментальной конечной точке соберите мозг и заморозьте мозг, чтобы можно было получить корональные срезы толщиной 40 микрометров с помощью криостатного микротома, и поместите срезы в отдельные лунки 24-луночного клеточного культивального планшета в криозащитном растворе в порядке их сбора. Когда все срезы будут собраны, храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия до нескольких месяцев.

Для оценки окрашивания BrdU, используя пероксидазную реакцию, с комплексом авидин-биотин-пероксидаза, переносят срезы из раствора криозащиты в 0,1 молярного PBS до тех пор, пока образцы не достигнут комнатной температуры, и промывают ткани три раза в течение 10 минут свежим 0,1 молярного PBS на промывку. После последнего промывки инкубирует срезы в растворе, блокирующем эндогенную пероксидазу, в течение 30 минут, при комнатной температуре, после чего следует три 10-минутных промывки в 0,1 моляра PBS. После последней промывки срезы инкубировать в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия в двух молярах соляной кислоты с последующим последующим однократным 10-минутным промыванием в 0,1 молярном боратном буфере.

После трех промывок в ледяном 0,1 моляре PBS образцы инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре в блокирующем растворе PBS+, после чего проводят ночную инкубацию с первичным антителом мыши Anti-BrdU в PBS+ при четырех градусах Цельсия. После трех промывок PBS 0,1 моляра инкубируйте образцы в течение двух-четырех часов с соответствующим биотинилированным вторичным антителом мыши в PBS+ при комнатной температуре. После промывки обработайте срезы раствором ABC в течение одного часа при комнатной температуре, после чего последует три промывки PBS по 0,1 моляра.

После последней промывки переложите срезы в раствор субстрата DAB-пероксидазы на две-10 минут, пока срезы не станут темно-серыми. Если можно визуализировать положительные клетки, промойте образцы тремя 15-минутными промывками водопроводной водой, а затем тремя промывками PBS 0,1 моляра. После последней промывки с помощью мягкой щетки аккуратно закрепите ломтики на желатинизированных предметных стеклах, для сушки на воздухе в течение ночи при комнатной температуре.

На следующее утро используйте постоянный монтажный носитель, чтобы разместить крышки на образцах. Чтобы количественно определить BrdU-положительные клетки, сначала используйте 4-кратное увеличение на микроскопе, чтобы идентифицировать зубчатую извилину и тщательно искать ядра, меченные BrdU, в слое зернистых клеток вдоль оси Z. После выбора интервального участка для поиска клеток по всей зубчатой извилине подсчитайте все BrdU-положительные клетки.

Морфология меченого ядра может меняться в зависимости от того, сколько BrdU было включено в клетку. Медленно перемещайтесь по оси Z, чтобы количественно оценить все ядра по крайней мере из 10 секций на животное и не менее пяти животных на группу, которые составляют кластер. Для деконволюции изображения откройте 3D плагин функции распространения дифракционной точки, заполните все необходимые данные, нажмите OK и сохраните файл.

Затем откройте плагин DeconvolutionLab2 и перетащите совпадающее изображение Z-стека и PSF-файл в соответствующий слот окна. Выберите алгоритм деконволюции, количество итераций и нажмите кнопку «Выполнить». Чтобы объединить деконволютированные изображения в одно изображение Z-стека, выберите «Изображение и стек» и нажмите «Проект Z».

В меню типа проекции выберите «Максимальная интенсивность». Нажмите OK и сохраните файл. Чтобы создать изображение RGB, выберите «Изображение и цвет» и нажмите «Объединить каналы», чтобы задать нужное цветовое канал для соответствующего изображения в раскрывающемся меню.

Затем снимите галочку с опции Создать составной элемент. Нажмите OK и сохраните файл. Когда все изображения каналов будут созданы, откройте по крайней мере два файла изображений и выберите разные цветовые каналы для каждого файла изображения, чтобы создать изображение RBG.

На этих изображениях можно наблюдать репрезентативные срезы зубчатой извилины с мечеными BrdU клетками. Как видно на этих увеличенных изображениях срезов, меченые клетки демонстрируют интенсивное темное окрашивание. Следует отметить, что существуют значительные различия в количестве положительных клеток BrdU между контролируемыми крысами, которые не подвергались физической активности, и экспериментальной группой, которая подвергалась физической активности, что согласуется с другими опубликованными результатами, которые продемонстрировали, что физическая активность увеличивает клеточную пролиферацию во взрослой зубчатой извилине.

При использовании этого протокола используйте свежеприготовленные растворы и аккуратно обращайтесь с тканью. Гиппокамп подвержен отделению от остальных предметных стекол при обработке через него и может быть пропущен. Эта методика может быть адаптирована для оценки маркировки ДНК и индекса синтеза ДНК и исследований пролиферации клеток с двойным окрашиванием.

Мы надеемся, что эта работа была полезна научному сообществу и облегчила ответы на новые вопросы в изучении пролиферации клеток при использовании метода иммуногистохимии.