Прямая электроретинограмма (DC-ERG) для записи световых электрических реакций мыши Сетчатки Пигмент Эпителий

Метод DC-ERG может быть использован для неумязвимой оценки функции эпителия пигмента сетчатки для мониторинга возрастных изменений или прогрессирования заболевания и оценки фармакологических эффектов вмешательства. Этот метод улучшает способность воспроизведения DC-ERG и простоту использования путем упрощения подготовки капиллярных электродов. Он также может быть дополнен стандартным ohm программное приложение для облегчения анализа.

Начните с тщательного скольжения 25-го калибра шприц иглы через силиконовую резиновую прокладку к задней стенке держателя электрода. Заполните основание держателя электрода дегазатным HBSS, медленно убирая иглу, заботясь о том, чтобы не вводить пузырьки, и замените резьбовую крышку без затягивания. Reinsert шприц иглы, чтобы заполнить пустое пространство в зазоре с HBSS и держать капилляры горизонтально при заполнении, чтобы предотвратить решение побега с другого конца.

Хватая заполненные капилляры на согнутом конце, медленно вставьте другой конец через ослабленную крышку и затяните крышку винта на место. Наклоните держатели электродов капиллярными электродами, обращенными вверх, чтобы позволить любым пузырям вытекать и дегализировать капилляры в вакуумной камере в течение пяти-десяти минут. Затем медленно отпустите вакуум и пополнить держатели электродов и стеклянные капилляры, как попродемонстрировано.

Чтобы сделать пользовательский стенд для держателя микроэлектрода, удалите черные полиацетальные зажимы с одной стороны числа восемь T-клип и использовать основание цилиндра с магнитными шаровыми суставами, обученными пополам, чтобы регулировать высоту. Безопасные модифицированные T-клипы на магнитный шар монтажа винты с M3-размер орехи и слайд примерно в один дюйм конические деревянные ручки, измененные из хлопка наконечник очистки палку, в стенд под углом, чтобы обеспечить микроэлектроник держатель в заказ T-клип магнитного шара совместных стенд. Затем используйте редкоземельные магниты цилиндрической базы, чтобы надежно располагать индивидуальный держатель электрода стоять на металлической пластине сцены, что позволяет 360-градусное вращение на 180-градусной оси.

Для выполнения электродного теста, во-первых, аккуратно опустите полностью собранные микроэлектрозы HBSS в небольшой контейнер HBSS. Поместите электрод иглы и серебряный, серебристый хлорид в центре гранулы эталонный электрод в том же HBSS для завершения цепи и выбрать или создать соответствующий идентификатор для описания мыши для тестирования. Чтобы выбрать протокол прямой электроретинограммы, нажмите протоколы и выберите DC-ERG.

Нажмите запустить. Диалоговое окно будет всплывающее с информацией о пациенте. Если информация верна, нажмите "да" и перейти к шагам один из шести.

Закройте двери в клетку Фарадея и нажмите impedance, чтобы отобразить режим неустумности. Убедитесь, что значения для ссылки на рот, хвост земли и записи электродов являются приемлемыми и нажмите шаг, чтобы перейти к шагу четыре из шести, чтобы проверить базовую стабильность. Чтобы начать просмотр следов, нажмите предварительный просмотр.

Следы должны быть низким уровнем шума с пик-пик амплитуды менее 200 микровольт. Чтобы расповести мышь и электроды для эксперимента, анестезировать роговицу под наркозом мыши с каплей 5%proparacaine соляной кислоты перед расширением роговицы с каплей 2,5%фенилэфрин HCL и 5%тропикамид. В программном обеспечении системы ERG убедитесь, что выбран правильный пациент.

Нажмите протоколы. Под описанием протокола выберите DC-ERG и нажмите кнопку запуска. Нажмите "да", чтобы убедиться, что правильный тест выполняется.

Используйте шаг один из шести, чтобы включить тусклый красный свет внутри купола и поместить мышь на нагретом записывающем столе. Используйте типсы, чтобы тщательно палатку кожи задней ноги. И используя одну руку, чтобы твердо держать игольчатый электрод, используйте другую руку, чтобы вставить электрод подкожно в заднюю ногу, чтобы обеспечить электрод на место.

Поместите эталонный серебристый электрод хлорида в рот животного так, чтобы центрированная гранула покоиться вдоль задней щеки и удерживалась на месте за зубами. Перед размещением капиллярных электродов на глаз, положение электрода держатель со стеклянными капиллярами ориентированы вертикально и Флик держатель электрода указательным пальцем, чтобы удалить любые пузырьки, которые, возможно, были введены. Используйте 25-калибровочный иглы, чтобы заполнить капиллярные советы с HBSS и проверить капилляры, чтобы убедиться, что Есть нет пузырьков воздуха в ловушке в советы.

Позиция держатель электрода стоять так, что открытые кончики HBSS заполненные капилляры находятся в нежном контакте с роговицей. И заботы, чтобы избежать введения пузырьков, инвертировать смазки глаз гель дозатор отказаться от первоначальных капель. Затем поместите каплю смазочного геля для глаз на каждый глаз, чтобы сохранить проводимость и предотвратить высыхание во время записи.

Чтобы записать DC-ERGs, нажмите шаг, чтобы выбрать пятый шаг из шести и нажмите impedance использовать экран проверки impedance для изучения сопротивления левого и правого глаз. Значения неустумности для записывающих электродов на каждом глазу должны быть схожими. А значения неустумности как для наземных, так и для эталонных электродов должны быть менее 10 киломов.

Нажмите предварительный просмотр, чтобы просмотреть следы для левого и правого глаз и ждать до 10 минут для стабильной базовой линии, которая будет достигнута. Затем нажмите стоп, чтобы выйти из предварительного просмотра трассировки и нажмите запустить, чтобы начать запись. Здесь показан набор выборочных данных от условного нокаута и мышей дикого типа.

В этом анализе, след страдал от мельчайших пузырьков в электроде. Это увеличило пик-пик шума в след. В отдельном анализе пузырьки были устранены с помощью вакуумной камеры перед сборкой микроэлектродов в стендах держателя электрода.

Можно рассчитать наилучшие линии соответствия первоначальным 25 секундам, что позволит отколоть скорректированные ответы и определить амплитуды компонентов DC-ERG. Как и ожидалось, снижение экспрессии лечения 7,1 калийных каналов в RPE значительно снижает c-волновые и быстрые колебания, что свидетельствует о значительном ухудшении электрических свойств пигмента сетчатки. Здесь показаны относительные амплитуды компонентов DC-ERG, нормализованные до дикого типа и построенные против относительно двух самых больших световых амплитуд.

Эта форма анализа может определить, можно ли объяснить снижение электрических реакций RPE только снижением активности фоторецептора. Или, если есть основной дефект, который возникает в RPE. Не забудьте достичь стабильной базовой линии до перехода к записи мыши и периодически пересматривать электроды для пузырьков, которые, возможно, были введены.

Темно-адаптированные ERG могут быть записаны до DC-ERG для измерения конусо-управляемой функции сетчатки. Свето-адаптированные ERGs также могут быть выполнены после DC-ERG для оценки конусо-управляемых реакций сетчатки.