Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии

Этот протокол позволяет проводить неразрушающую визуализацию с неповрежденным или мягким лабораторным микронным разрешением. Он может быть использован для понимания механизмов физиологии, анатомии и развития животных. Поскольку мухи визуализируются в неповрежденном состоянии без необходимости рассечения тканей, пространственная архитектура тканей и органов сохраняется в их естественном состоянии и легко наблюдается.

Микрокомпьютерная томография является идеальным инструментом для исследований, направленных на моделирование заболеваний человека у мух, или для понимания дефектов развития, влияющих на качество жизни. Он также оказался полезным в других дисциплинах, таких как инженерия, физика, материаловедение, геология и антропология. После выбора интересующей точки времени развития для визуализации пересадите от 5 до 20 животных в один миллилитр PBST в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте пробирку в течение пяти минут при комнатной температуре с периодическим постукиванием, чтобы помочь удалению гидрофобного покрытия и позволить животным полностью погрузиться в воду.

В конце инкубации замените PBST одним миллилитром раствора Буина и постучите по трубке, чтобы полностью погрузить мух. Для образцов личинок и куколок после двухчасовой инкубации при комнатной температуре промойте животных три раза в течение пяти минут и получите один миллилитр свежего PBS за одну промывку. После последней промывки перенесите образцы в многолуночную чашку для препарирования, содержащую свежий PBS на лунку под микроскопом для препарирования, и с помощью небольшой булавки, прикрепленной к держателю, проделайте отверстие в передней и задней кутикуле каждого образца, стараясь не повредить подлежащие мягкие ткани.

После проникновения в кутикулу инкубируйте образцы в одном миллилитре свежего раствора Буина в новой 1,5-миллилитровой пробирке в течение 24 часов при комнатной температуре, а затем трижды промывайте образец в течение 30 минут и в одном миллилитре одного буфера для промывки микроКТ за одну промывку. После последней промывки добавьте в пробирку один миллилитр соответствующего раствора для окрашивания и инкубируйте образцы при комнатной температуре от двух до семи дней. Если требуется более длительное сохранение изображения, обезвоживайте образцы в восходящем ряду этанола в одном миллилитре этанола в течение одного часа для каждой концентрации, как указано, чтобы подготовить образцы к сушке в критических точках.

Чтобы установить высушенные в критических точках образцы, поместите образцы в пластиковые или стеклянные капиллярные пробирки перед установкой пробирок на вращающийся держатель предметного столика. Для монтажа гидратированного образца наполните наконечник пипетки P10 водой и зафиксируйте узкий конец парафиновой пленкой. С помощью щипцов перенесите один образец на наконечник пипетки и с помощью длинного тонкого предмета осторожно вдавите образец внутрь наконечника до тех пор, пока он не соприкоснется со стенкой наконечника, удерживая образец на месте.

Закрыв открытый конец пипетки, установите пипетку P10 на держатель, который должен помещаться в упор вращающегося предметного столика. Для сканирования нажмите значок «Открыть дверь» в программном обеспечении сканера, чтобы получить доступ к вращающемуся противооткатному столику, и затяните воротник вокруг основания держателя образца, чтобы прикрепить образец. Установите параметры сканирования в программном обеспечении для оптимального разрешения и контрастности и нажмите «Параметры» и «Источник рентгеновского излучения», чтобы открыть регулятор мощности источника рентгеновского излучения.

Используйте ползунки, чтобы установить рентгеновское напряжение на 30-40 киловольт и ток на 100-110 микроампер, чтобы создать рентгеновский луч мощностью от трех до четырех ватт и небольшим размером пятна. Чтобы задать количество проекционных изображений, которые будут получены во время сканирования, выберите «Параметры» и «Режимы съемки», чтобы установить время экспозиции камеры от 500 до 800 миллисекунд, и используйте ползунок, чтобы установить желаемый размер изображения в пикселях в соответствии с настройками и положением камеры. Щелкните и перетащите ползунок, чтобы переместить образец по траектории вращения на 360 градусов, удерживая образец в поле зрения.

Нажмите на значок начала приобретения. Появится диалоговое окно, в котором можно задать дополнительные параметры сканирования. Назовите файл и выходную папку, в которую будет сохранен скан.

Установите случайное движение на 10, а среднее на четыре-шесть кадров. Шаг поворота будет автоматически рассчитан в зависимости от используемых настроек камеры, затем нажмите «ОК», чтобы начать съемку. Появится диалоговое окно индикатора выполнения, показывающее время сканирования, и сканер начнет получать серию проекционных изображений образца вдоль траектории вращения.

Чтобы создать томограммы, откройте проекционные изображения в программе реконструкции и выберите алгоритм коррекции сдвига для выполнения первоначального выравнивания изображения. Выберите наилучшее значение, которое правильно выравнивает проекционные изображения, и нажмите Тонкая настройка, чтобы точно настроить каждый параметр реконструкции. Будет сгенерирована серия превью, которые можно использовать для выбора правильных значений.

Убедитесь, что оптимальные значения параметров отображаются на вкладке Настройки, а на вкладке Вывод настройте параметры файла, такие как битовая глубина, имя файла и папка, в которую будут сохраняться данные. Область интереса может быть использована только для реконструкции интересующих структур. Если требуется несколько реконструкций, нажмите кнопку Запустить и добавить в пакет, чтобы добавить текущее изображение в диспетчер пакетной обработки и повторить реконструкцию для оставшихся изображений.

Для морфометрического анализа восстановленных изображений на вкладке «Сегмент» в соответствующей программе морфометрического анализа нажмите «Основные» и «Новый», присвойте изображению новое имя и выберите подходящий цвет. Отметьте опцию Определить диапазон и отрегулируйте ползунок, чтобы настроить пороговый диапазон, охватывающий интересующую структуру. Чтобы закрасить область, определенную пороговым значением, нажмите и удерживайте клавишу Control, удерживая левую клавишу мыши.

Чтобы удалить область, нажмите и удерживайте клавишу Shift, удерживая левую клавишу мыши. Убедитесь, что измерения интересующей области сетки отображаются на информационной панели для базового морфометрического анализа. Выполните рендеринг объекта-сетки и всего изображения томограммы и визуализируйте полученное изображение в 3D, затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «Показать киностудию», чтобы создать видео объекта с использованием отдельных кадров из средства просмотра.

На этих изображениях можно наблюдать эмбрион, личинку третьего возраста, куколку на взрослой стадии феррата и взрослую самку мухи, окрашенную йодом и визуализированную в воде с помощью коммерческого настольного сканера. Превосходная сохранность и равномерное окрашивание нежной ткани очевидны, что позволяет легко идентифицировать все основные органы. Здесь показано сравнение одной и той же головы взрослой мухи, полученной в режиме медленного и быстрого сканирования проекции.

Важно отметить, что, несмотря на то, что разрешение медленных изображений выше, морфометрический анализ не отличается между медленным и быстрым сканированием. С помощью программного обеспечения для рендеринга любая представляющая интерес тканевая или органная система может быть сегментирована и использована для морфометрического анализа и 3D-визуализации. На этих изображениях можно наблюдать брюшную полость мухи, окрашенную фосфовольфрамовой кислотой и визуализированную в состоянии гидратации воды или после сушки в критической точке на рентгеновском микроскопе.

С помощью фосфовольфрановой кислоты отдельные эпителиальные клетки средней кишки и пучки сперматозоидов в яичках легко растворяются. В то время как изображения сушки в критических точках показывают незначительно повышенное разрешение по сравнению с гидратированным образцом, лучшее сохранение ультраструктуры нежных тканей достигается с гидратированными образцами, такими как жировые клетки вблизи кутикулы. Для достижения наилучшего разрешения ограничьте движение образца и избыточные вибрации.

Для этого критически важно закрепить образец на сцене, хотя для этого могут потребоваться творческий подход и находчивость. Дополнительные методы визуализации, такие как световая и электронная микроскопия, могут быть использованы в рамках рабочего процесса визуализации, чтобы понять мутацию данного гена от наномасштаба до всего организма.