Изоляция и культивирование мюндибулярных костных костных костных мозга мезенхимальных стволовых клеток у крыс
25 августа 2020 г.
В этой статье представлен метод, который сочетает в себе соблюдение всего костного мозга и цитометрии потока сортировки для изоляции, культивирования, сортировки и выявления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из крысиных челюстей.
Исследования показали, что BMSC, полученные из черепной лицевой кости, демонстрируют превосходные возможности, чем из аксиальных и аппендикулярных костей. Таким образом, БМСК нижней челюсти считаются предпочтительным ресурсом для разработки будущих методов лечения черепно-лицевых заболеваний. Этот протокол сочетает в себе преимущества адгезии цельного костного мозга и сортировки флуоресцентных клеток для получения значительного количества очищенных БМСК нижней челюсти за короткое время.
Если вы пробуете этот протокол впервые, я думаю, что очень важно понимать анатомическую структуру и функциональное движение нижней челюсти крысы, чего можно достичь, посмотрев это видео или прочитав соответствующую литературу. После усыпления крысы поместите ее в чистый вытяжной шкаф в лежачем положении. Разрежьте кожу и мышцы букцинатора от двустороннего angulus oris до задней области нижней челюсти.
Откройте рот крысы, сдвинув верхнечелюстные и нижнечелюстные резцы в противоположном направлении обоими большими пальцами, чтобы обнажить зубы нижней челюсти, которые прикреплены к нижней челюсти. Полностью отсоедините щечные мышцы и сухожилия, прикрепленные к коракоидам и нижней границе нижней челюсти. Затем надавите на задние зубы нижней челюсти и вращайте их вперед и вниз до тех пор, пока мыщелки с обеих сторон не станут четко обнажены.
Отделите тело нижней челюсти от черепа и очистите прилегающие мягкие ткани на поверхности кости с помощью влажной марли. Поместите косточку в 10-сантиметровую стерильную стеклянную посуду, наполненную предварительно охлажденной минимально необходимой средой альфа, или PBS на льду, чтобы сохранить жизнеспособность. Отрежьте переднюю кость вдоль мезиального края первого моляра от тела нижней челюсти, затем удалите ветвь нижней челюсти, включая коракоид и мыщелок вдоль дистального края третьего моляра, чтобы обнажить полость костного мозга.
Наполните 10-сантиметровую миску из стерильного стекла 10 миллилитрами альфа-МЕМ с 10% FBS. Отсадите среду с помощью шприца объемом 10 миллилитров, затем введите иглу в полость костного мозга и многократно промойте костный мозг в чашку. Промойте костную полость не менее трех раз с мезиальной и дистальной сторон кости соответственно, пока кость не станет белой.
Переложите среду, содержащую промытые клетки, в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте со скоростью 800 об/мин в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки тремя миллилитрами альфа-MEM с 10% FBS. Поместите клетки в новую 10-сантиметровую чашку для культивирования и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа.
Отсадите питательную среду и вымойте посуду с помощью PBS. Добавьте в чашку два миллилитра 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА и переваривайте клетки при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте четыре миллилитра альфа-MEM с 10% FBS, чтобы остановить реакцию.
Переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте ее при 800 оборотах в минуту в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в 120 микролитрах PBS с 10% FBS после центрифугирования. Перелейте 100 микролитров клеточной суспензии в новую микроцентрифужную пробирку.
Заблокируйте клеточные суспензии одним микролитром антитела против CD16 - CD32 при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут и окрашивайте клетки PE-конъюгированным антителом против CD45, FITC-конъюгированным антителом против CD90 и APC-антителом против CD29 при четырех градусах Цельсия в течение одного часа в темноте. Используйте остальные 20 микролитров клеточной суспензии в качестве неокрашенного отрицательного контроля. Центрифугируйте пробирки при 800 об/мин в течение пяти минут.
Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл PBS с 10% FBS. Добавьте 10 микролитров 0,01 миллиграмм на миллилитр DAPI за 10 минут до анализа. Используйте 40-нанометровые фильтры, размещенные на центрифужных пробирках, для фильтрации клеток, а затем проанализируйте клетки на флуоресцентно-активируемом сортировщике клеток.
Сначала удалите мертвые клетки из общего количества клеток путем гейтирования DAPI-отрицательных клеток, затем определите CD29-положительные, CD90-положительные, CD45-отрицательные в выбранных клетках в качестве целевых mBMSC. Соберите отсортированные mBMSC в 15-миллилитровую центрифужную пробирку с пятью миллилитрами альфа-MEM с 10% FBS. Центрифугируйте пробирки при 800 об/мин в течение пяти минут и снимите коллекторный буфер.
Добавьте один миллилитр свежей среды, чтобы суспендировать клетки, затем поместите их в шестисантиметровую чашку для культивирования. Используя этот протокол, большая часть клеток прилипла к планшету на третий день после первоначального посева. После дополнительных трех-четырех дней культивирования слияние клеток достигало 70-80%Флуоресцентная сортировка клеток использовалась для очистки mBMSC, которые составляли около 81,1% в клетках P0.
После культивирования P2 mBMSC в шестилуночном планшете в течение недели наблюдалось значительное количество колониеобразующих единиц. Для оценки многолинейной дифференцировочной способности mBMSC их индуцировали в остеохондро- и адиполинии. Повышенная активность ЩФ, красных кальцифицирующих узелков при окрашивании ализарином в красный цвет и повышенная экспрессия остеогенных специфических генов Runx2, Alp, Bsp и Ocn указывали на остеогенную индукцию.
Для выявления адипогенеза использовалось окрашивание масляным красным цветом. Многочисленные богатые липидами вакуоли были заметны после девяти дней индукции. Кроме того, была увеличена экспрессия адипогенных специфических генов Ppar-gamma-1 и Cebpa.
Образцы показали положительное окрашивание на альцианский синий при микроскопическом наблюдении хондрогенной дифференцировки. Кроме того, иммуноокрашивание антителами к коллагену II типа показало усиленное накопление хрящевого матрикса. В этом протоколе очень важно обеспечить жизнеспособность mBMSC.
Эта цель может быть достигнута путем выбора подходящего экспериментального животного, работающего на льду, и сокращения времени эксперимента. Используя эту модель in vitro, можно получить большое количество пролиферативных БМСК нижней челюсти, что может облегчить изучение биологических характеристик, последующей реакции на микроокружение и другие применения БМСК нижней челюсти.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод, сочетающий адгезию всего костного мозга и сортировку методом проточной цитометрии для выделения, культивирования, сортировки и идентификации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из нижней челюсти крысы. МСК костного мозга нижней челюсти считаются предпочтительным ресурсом для разработки методов лечения заболеваний челюстно-лицевой области.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Исследования стволовых клеток
- Биология краниофациальных структур
Теоретические основы
- БМСК, полученные из костей черепа и лица, обладают более высокими способностями по сравнению с клетками из других костей.
- Для данного протокола критически важно понимание анатомии и подвижности нижней челюсти крысы.
- Метод направлен на эффективное получение значительного количества очищенных БМСК нижней челюсти.
- Ознакомление с соответствующей литературой и видеоматериалами может способствовать лучшему пониманию процедуры.
Цель исследования
- Изолировать и культивировать мезенхимальные стволовые клетки костного мозга из нижних челюстей крыс.
- Предоставить надежный протокол для исследователей в области терапии краниофациальных заболеваний.
- Осветить анатомические особенности, необходимые для успешного выделения клеток.
Используемые методы
- Метод адгезии цельного костного мозга.
- Сортировка методом проточной цитометрии для очистки клеток.
- Подготовка нижних челюстей крысы после эвтаназии.
- Методы рассечения для доступа к нижней челюсти.
Основные результаты
- Успешное выделение значительного количества МСК нижней челюсти.
- Демонстрация эффективности комбинированного метода.
- Понимание анатомического строения, способствующее проведению процедуры.
- Потенциальные возможности применения в терапии краниофациальных заболеваний.
Выводы
- Данный протокол представляет собой эффективный метод выделения БСКМ.
- Понимание анатомии имеет решающее значение для успешного применения метода.
- БСКМ нижней челюсти перспективны для будущих терапевтических разработок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение высокоочищенных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга челюстно-лицевой области способствует валидации мишеней в регенеративной медицине, обеспечивая биологически релевантный источник клеток с высоким дифференцировочным потенциалом. Данный метод позволяет быстро получать пролиферирующие mBMSCs для доклинических исследований, что облегчает механистическое снижение рисков при разработке терапевтических кандидатов для лечения заболеваний челюстно-лицевой области. Доступ к хорошо охарактеризованным стволовым клеткам повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска путем моделирования реакций тканей человека в системе, релевантной конкретному заболеванию.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать биологию мезенхимальных стволовых клеток в контексте, специфичном для краниофациальной области, для проверки целевых гипотез.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый источник очищенных mBMSCs посредством адгезии и флуоресцентно-активированной сортировки для получения единообразных экспериментальных материалов.
- Научная ценность: поддерживает функциональную валидацию стволовых свойств путем мультилинейной дифференцировки по остеогенному, адипогенному и хондрогенному путям.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение стандартизированных mBMSC с контролируемым числом пассажей, пригодных для разработки методов анализа цитотоксичности, миграции или скрининга дифференцировки.
- Практическая ценность: получение большого количества клеток с чистотой >80% после сортировки P0, что позволяет проводить масштабируемые анализы на планшетах.
- Научная ценность: получение количественных показателей, таких как активность ALP, наличие липидных вакуолей и окрашивание матрикса для фенотипического скрининга специфических линий клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Использование системы, релевантной для заболевания (нижнечелюстная кость), для моделирования регенерации краниофациальных тканей и взаимодействий в микроокружении.
- Практическая ценность: Поддержка пролонгированного культивирования (P2) для оценки колониеобразующей способности и долгосрочного пролиферативного потенциала.
- Научная ценность: Обеспечение возможности проведения исследований с использованием биомаркеров посредством валидированных поверхностных маркеров (CD29+CD90+CD45−) для обеспечения трансляционной преемственности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки — обеспечивая на каждом этапе получение клеток с информативными механистическими характеристиками.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о поведении ниши стволовых клеток и определении их линии с использованием очищенных первичных клеток.
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению анализа за счет стандартизированных адгезивных культур с количественно определяемыми результатами дифференцировки.
- Аналитика: предоставляет количественную оценку на основе проточной цитометрии и данные иммунофлуоресценции для объективного сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет продемонстрированной трилинейной дифференцировки, имеющей значение для восстановления челюстно-лицевых тканей.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает многократно используемый рабочий процесс изоляции, применимый к нескольким моделям челюстно-лицевых заболеваний и кампаниям по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в путях регенерации, опосредованных стволовыми клетками.
- Операционная ценность: Стандартизирует получение клеток посредством определенных этапов адгезии и сортировки, что повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) за счет возможности ранней оценки клеточных ответов в физиологически релевантной модели.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию кандидатов для краниофациальной регенерации с учетом рисков, используя валидированные функциональные характеристики стволовых клеток.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области анатомии грызунов, асептического промывания костного мозга и сортинга клеток с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки.
- Необходимы стерильное оборудование для культивирования тканей, центрифуги, проточный цитометр и инвертированные микроскопы для валидации.
- Требуется стандартизация времени ферментативного переваривания, протоколов окрашивания антителами и стратегий гейтирования для всех операторов.
- При переносе метода на другие источники костной ткани или другие виды необходимо учитывать особенности адаптации в связи с анатомической вариабельностью.
- Ограничено необходимостью использования свежей ткани и короткими временными интервалами обработки после эвтаназии для сохранения жизнеспособности клеток.
