Обнаружение экспрессии микроРНК в почках мышей-нефропатических иммуноглобулинов А
8 июля 2020 г.
микроРНК участвуют в патогенезе IgA-нефропатии. Мы разработали надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии (мыши HIGA). Этот новый метод облегчит проверку участия микроРНК в IgA-нефропатии.
Этот метод может быть использован для легкой верификации изменения микроРНК при IGA-нефропатии с использованием модели небольшого животного, что позволяет изучать IGA-нефропатию без биопсии почки человека. Протокол может дать новое представление о генетике IGA-нефропатии, что потенциально может помочь в открытии новых диагностических и новых терапевтических методов для заболевания почек. Убедившись, что мышь должным образом обезболивается, с помощью хирургических ножниц и щипцов сделайте разрез средней линии длиной от трех до четырех сантиметров в брюшной стенке мыши и определите обе стороны почки.
Надрежьте ребра и диафрагму, чтобы обнажить сердце. После разреза правого предсердия вводите PBS в левый желудочек до тех пор, пока цвет почек не изменится на бледно-желтый, что указывает на то, что все тело мыши перфузировано PBS. Перережьте почечную артерию, почечную вену и мочеточник, затем удалите почку.
Гомогенизируйте 30-миллиграммовые образцы почек с помощью кремниевого гомогенизатора и 700 микролитров реагента для лизиса на основе фенолагуанидина при комнатной температуре. Перенесите лизат в отжимную колонну для измельчения биополимеров и центрифугируйте его при 15 000 G в течение двух минут при комнатной температуре. Продолжайте очищать RBNA, следуя указаниям рукописи.
После окончательной промывки добавьте 30 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте ее при 8 000 G в течение одной минуты для элюирования РНК. Для синтеза кДНК приготовьте мастер-смесь из двух микролитров смеси нуклеиновых кислот, двух микролитров смеси обратной транскриптазы и четырех микролитров буфера, всего восемь микролитров на образец. Добавьте восемь микролитров мастер-смеси в каждую лунку восьмилуночной трубчатой полоски.
Разбавьте общую РНК в воде, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте по 12 микролитров общего раствора РНК в каждую лунку полоски. Поместите образцы в термоамплификатор и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут, а затем при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Чтобы выполнить количественную ПЦР в реальном времени, приготовьте мастер-смесь в соответствии с инструкциями рукописи, затем добавьте 22,5 микролитра мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного реакционного планшета. Добавьте в каждую лунку по 2,5 микролитра подготовленной кДНК. Поместите реакционную пластину в прибор для ПЦР в реальном времени.
Затем запрограммируйте его на первоначальную активацию при 95 градусах Цельсия в течение 15 минут, за которыми последуют 40 циклов денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 15 секунд, отжиг при 55 градусах Цельсия в течение 30 секунд и удлинение при 70 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Количественная оценка экспрессии генов с помощью метода дельта-дельта КТ. Этот протокол был использован для исследования уровней экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA с использованием почек мышей Balb/c в качестве контроля.
Измеряли уровни экспрессии трех микроРНК, ассоциированных с нефропатией IGA. Относительные уровни экспрессии микроРНК в двух группах сравнивали с помощью Т-критерия, при этом P менее 0,05 является статистически значимым. miR-155-5p экспрессировался в 3,3 раза выше в группе HIGA по сравнению с контрольной группой, а miR-21-5p — в 1,58 раза выше.
Экспрессия miR-1461-5p существенно не различалась между двумя группами. При выполнении этого протокола важно носить маску, перчатки и кепку, а также содержать лабораторный стол и инструменты в чистоте, чтобы предотвратить воздействие нуклеазы в окружающей среде на эксперимент. Этот экспериментальный метод в настоящее время используется на практике в нашей лаборатории.
Его цель – создание новых диагностических и терапевтических методов лечения IGA-нефропатии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии. Этот метод позволяет изучать роль микроРНК при IgA-нефропатии без необходимости проведения биопсии почек человека.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нефрология
- Исследование микроРНК
- Животные модели
Теоретическое обоснование
- IgA-нефропатия — это заболевание почек, характеризующееся отложением IgA в клубочках.
- МикроРНК играют значительную роль в патогенезе различных заболеваний, включая патологии почек.
- Изучение экспрессии микроРНК может дать представление о механизмах развития заболевания.
- Современные методы исследования микроРНК часто требуют проведения инвазивных процедур.
Цель исследования
- Разработать метод оценки уровней микроРНК на мышиной модели IgA-нефропатии.
- Способствовать исследованию генетических аспектов IgA-нефропатии.
- Изучить потенциальные диагностические и терапевтические подходы при заболеваниях почек.
Используемые методы
- Использование мышей HIGA в качестве модели IgA-нефропатии.
- Введение анестезии мыши перед операционным вмешательством.
- Хирургические методы доступа к почкам, включая срединный разрез и извлечение органов.
- Перфузия мыши раствором PBS для подготовки к извлечению почек.
Основные результаты
- Разработанный метод позволяет легко верифицировать изменения микроРНК при IgA-нефропатии.
- Данные, полученные с помощью этого метода, могут привести к созданию новых диагностических инструментов.
- Потенциал для поиска новых терапевтических стратегий лечения IgA-нефропатии.
- Устранение необходимости проведения биопсии почек человека в предварительных исследованиях.
Выводы
- Данный метод углубляет понимание роли microRNA в развитии IgA-нефропатии.
- Он открывает новые возможности для исследования генетики заболеваний почек.
- Этот подход может оказать значительное влияние на будущие разработки в области диагностики и терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет научно-исследовательским группам в сфере биофармацевтики профилировать экспрессию микроРНК на валидированной мышиной модели IgA-нефропатии, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в программах по изучению заболеваний почек. Обеспечивая воспроизводимый метод обнаружения измененных уровней miRNA без проведения биопсии тканей человека, этот подход облегчает ранний поиск биомаркеров и терапевтических мишеней с повышенной прогностической достоверностью. Описываемый метод соответствует задачам стадии поиска (discovery stage), направленным на изучение механизмов заболевания и приоритизацию кандидатов для доклинической разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения изменений экспрессии ассоциированных с заболеванием miRNA у мышей HIGA по сравнению с контрольной группой.
- Практическая ценность: обеспечивает надежный рабочий процесс для функциональной валидации мишеней с использованием qRT-PCR для измерения уровней miR-155-5p, miR-21-5p и miR-146a-5p.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных проектов за счет выявления miRNA со статистически значимым изменением кратности экспрессии (например, в 3,3 раза для miR-155-5p) в качестве потенциальных биомаркеров или мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет количественные, воспроизводимые данные об экспрессии miRNA, пригодные для стандартизации анализа в рамках поискового скрининга.
- Практическая ценность: Устанавливает стандартизированный протокол очистки РНК и синтеза кДНК, совместимый с высокопроизводительными платформами qRT-PCR.
- Готовность анализа: Позволяет получать нормализованные значения CT с помощью метода delta-delta CT, что обеспечивает возможность сравнения образцов и подтверждения хитов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Использование релевантной для заболевания мышиной модели HIGA позволяет связать результаты первичных исследований с доклинической валидацией путей, опосредованных miRNA.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет оценить изменения экспрессии miRNA, связанные с отложением IgA, что уменьшает неопределенность в отношении целевого механизма перед идентификацией ведущего кандидата.
- Доклиническая преемственность: Обеспечивает принятие обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении исследования за счет получения согласованных количественных показателей из тканей почек во всех группах исследования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на ранних этапах процесса поиска новых лекарственных средств, обеспечивая проверку гипотез при валидации мишени и предоставляя количественные данные для рабочих процессов скрининга и анализа, которые служат основой для принятия решений по идентификации соединений-лидеров.
- Фундаментальная биология: позволяет уточнить механизмы сигнальных путей путем измерения изменений экспрессии miRNA, связанных с патогенезом IgA-нефропатии на генетической модели мышей.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных об уровне miRNA, подходящих для оценки влияния соединений на целевые пути в последующих анализах.
- Аналитика: позволяет рассчитывать значения delta-delta CT и показатели кратности изменения (fold-change), что дает возможность сравнивать условия и оценивать статистическую значимость с помощью T-критериев.
- Трансляционные исследования: связывает результаты изучения miRNA на этапе открытия с доклиническими исследованиями за счет использования валидированной модели IgA-нефропатии с соответствующим фенотипом.
- Повторное использование в организации: устанавливает воспроизводимый протокол экстракции РНК и qRT-PCR, применимый к нескольким мишеням miRNA в различных проектах по изучению заболеваний почек.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности путем прямого измерения дисрегуляции miRNA в модели заболевания.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию благодаря определенным параметрам очистки РНК, синтеза кДНК и qRT-PCR (например, центрифугирование при 8,000 G, инкубация при 37°C).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя статистически значимые данные об экспрессии (p<0.05) для приоритизации мишеней с сильной ассоциацией с заболеванием.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию биомаркеров или терапевтических мишеней на основе miRNA с учетом рисков, опираясь на величину кратности изменения (fold-change) и воспроизводимость.
Особенности реализации
- Требуются навыки проведения хирургических операций на грызунах, работы с РНК и проведения qRT-PCR для предотвращения деградации нуклеазами и обеспечения целостности образцов.
- Необходим доступ к гомогенизатору, центрифуге, термоциклеру и прибору для ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами в отношении количества исходного материала РНК (30 mg почки), объемов реагентов (700 μL лизирующего реагента) и условий циклирования (активация при 95°C, 40 циклов).
- Требуется адаптация наборов праймеров для конкретных мишеней miRNA при сохранении постоянных температур отжига (55°C) и элонгации (70°C).
- Метод ограничен конечным анализом РНК; без использования дополнительных методик он не обеспечивает пространственного разрешения или разрешения на уровне отдельных клеток в ткани почки.
