Трехмерное моторное нервное органоидное поколение

Этот протокол облегчает исследование механизмов, лежащих в основе развития и заболевания аксонных пучков, с использованием органоида двигательного нерва, полученного из iPS-клеток человека вне организма. Просто культивируя нейронный сфероид и изготовленные на заказ микрокультурные чипы, можно спонтанно генерировать однонаправленные пучки аксонов и использовать их для различных последующих экспериментов. Органоид двигательного нерва может облегчить скрининг и тестирование препаратов для лечения заболеваний двигательных нейронов, включая ЛС, обеспечивая более физиологическую модель, чем предыдущие системы in vitro.

В вытяжном шкафу и надев соответствующие СИЗ, нанесите три миллилитра SU-8 2100 на очищенную ацетоном силиконовую пластину и поместите пластину в центр отжимной машины. Зафиксируйте пластину с помощью вакуума и вращайте пластину со скоростью 500 оборотов в минуту в течение 10 секунд, чтобы равномерно покрыть SU-8 по поверхности пластины, затем вращайте пластину со скоростью 1 500 оборотов в минуту в течение 30 секунд с ускорением 300 оборотов в секунду, чтобы получить слой фоторезиста толщиной 150 микрон на пластине. После мягкого запекания установите фотомаску на выравниватель маски и подвергните пластину воздействию ультрафиолета в течение 60 секунд.

После запекания на горячей плите проявите в течение 10-20 минут в проявителе фоторезиста с перемешиванием на орбитальном шейкере, меняя проявочный раствор один раз за процесс. Чтобы подготовить нижний слой чипа к культуре тканей, насыпьте свежеприготовленный PDMS на пластину до нужной толщины и дегазируйте смесь в вакуумной камере. Отверждайте PDMS в духовке не менее трех часов при температуре 60 градусов Цельсия.

После охлаждения с помощью лезвия вырезайте отвержденный PDMS из пластины, затем используйте неотвержденный PDMS с запеканием для приклеивания резервуара среды к нижнему слою PDMS для получения собранного чипа для культуры тканей PDMS. Чтобы подготовить чип PDMS к образованию органоидов двигательных нервов, простерилизуйте чип и стекло микроскопа размером 76 на 52 мм в чашке Петри, содержащей 70% этанола, в течение не менее одного часа. По окончании инкубации поместите чип на мокрое стекло микроскопа.

После ночного высыхания скол должен прилипнуть к стеклу. Поместите каплю разбавленной матрицы базальной мембраны объемом 30 микролитров в DMEM/F12 с одной стороны входного отверстия канала и аспирируйте раствор с другой стороны входного отверстия, чтобы покрыть поверхность микроканала матрицей. Затем инкубируйте чип PDMS с раствором покрытия в чашке Петри в течение одного часа при комнатной температуре.

Чтобы индуцировать дифференцировку 3D iPS-клеток в моторные нейроны, засейте четыре раза по 10-44 iPS-клеток на лунку в соответствующее количество лунок 96-луночного U-образного планшета в 100 микролитров питательной и бессывороточной клеточной питательной среды с добавлением 10 микромоляров Y-27632. На следующий день замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 100 микролитров среды КСР с добавлением 10 микромолярных SB431542 и 100 наномоляров LDN-193189. На второй и третий дни замените надосадочную жидкость на 100 микролитров среды KSR с добавлением 10 микромолярных SB431542, 100 наномоляров LDN-193189, пяти микромоляров DAPT, пяти микромоляров SU5402, одного микромолярного ретиноевой кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста.

На четвертый и пятый дни замените надосадочную жидкость смесью 75% среды KSR и 25% среды N2 с добавлением 10 микромолярных SB431542, 100 наномолярных LDN193189, пяти микромоляров DAPT, пяти микромоляров SU5402, одного микромолярного ретиноевого кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста. На шестой и седьмой дни замените надосадочную жидкость смесью 50% среды KSR и 50% среды N2 с добавлением пяти микромоляров DAPT, пяти микромоляров SU5402, одной микромолярной ретиноевой кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста. На восьмой и девятый дни замените надосадочную жидкость смесью 25% среды KSR и 75% среды N2 с добавлением пяти микромоляров DAPT, пяти микромоляров SU5402, одной микромолярной ретиноевой кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста.

На 10-й и 11-й день замените надосадочную жидкость средой N2 с добавлением пяти микромоляров DAPT, пяти микромоляров SU5402, одной микромолярной ретиноевой кислоты и одного микромолярного разглаженного агониста. На 12-й день замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 100 микролитров среды для созревания с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга на лунку. Чтобы индуцировать образование органоидов моторных нервов, замените раствор покрытия в чипе PDMS на 150 микролитров среды созревания с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга и используйте широкий наконечник микропипетки для аккуратного добавления сфероидов моторных нейронов из одной лунки 96-луночной пластины во входное отверстие микроканала чипа.

Поместите небольшой резервуар со стерильной водой рядом с чипом для культуры тканей в чашку, чтобы предотвратить испарение среды, и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. Каждые два-три дня заменяйте половину истощенной питательной среды из центра резервуара среды свежей средой для созревания с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга. Аксоны вырастают из сфероида мотонейронов в канал, спонтанно собираясь в один пучок в течение двух-трех недель, образуя органоид моторного нерва.

Моторные нейроны дифференцируются в течение 12-14 дней при процедурах 3D-дифференцировки. Важно отметить, что более 60% клеток экспрессируют маркер моторных нейронов HB9 во время дифференцировки, и примерно 80% клеток сфероида моторных нейронов являются SMI32-положительными. Благодаря тому, что микроканал служит физическими проводниками, аксоны удлиняются от сфероида мотонейрона, образуя пучок аксо-аксонального взаимодействия в течение 24 часов после введения в сфероид.

Аксоны достигали центра микроканала в течение следующих трех-четырех дней, распространяясь на другой конец микроканала еще через 10 дней. Моторные нервные органоиды могут быть собраны из чипа для биологического анализа, если отсоединить PDMS от стекла микроскопа. Затем пучки аксонов и тела клеток могут быть препарированы и изолированы под микроскопом с помощью хирургического ножа или пинцета.

В аксонных пучках моторных нервных органоидов дендритные маркерные белки не обнаруживаются с помощью вестерн-блоттинга. Важно убедиться, что сфероиды полностью опустились на дно внутри чипа культуры. Показанный нами осмотр участков и дна может помочь определить расположение сфероида в чипе.

Выделенные пучки аксонов могут быть исследованы с помощью различных дополнительных методов. Большое количество аксонов может быть получено и использовано для биохимических анализов, что требует значительных материалов.