Подход к изучению зависимых от форм транскриптомики на уровне одной клетки

Мы предлагаем новую платформу для исследования влияния формы клеток на экспрессию генов, используя методы для выращивания и сортировки приверженности с различными морфологиями на уровне одной клетки. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает высокую пропускную способность изучения формы клеток in vitro, так как сравнение клеток с различными формами in vivo является технически требовательным. Чтобы создать узорчатую культуру кардиомиоцитов, перенесите подвеску кардиомиоцитов в аспекте соотношения интереса к 15 миллилитровой трубке для подсчета и разбавления клеток в один раз от 10 до пяти клеток на миллилитр соответствующей средней концентрации покрытия.

Добавьте два миллилитров клеток на фибронектин покрытием микропаттернированный чип, погруженный в два миллилитров теплого покрытия среды внутри 35 миллилитров Grenier Петри блюдо и поместите блюдо в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ инкубатор в течение 18 часов. На следующий день проверьте чип с помощью световой микроскопии, чтобы подтвердить, что большинство клеток прикрепились. Удалите среду из блюда, чтобы удалить любые мусора и или мертвых клеток, и, начиная с центра и двигаясь в стороны в капле мудрый моды, осторожно добавить PBS в клетки.

После третьей стирки замените PBS четырьмя миллилитровами среднего обслуживания и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. После 72 часов, осторожно промыть поверхность чипа два раза с двумя миллилитров теплой Dulbecco PBS за стирку, как попродемонстрировано, и использовать типсы, чтобы немедленно передать вымытый чип в новый стерильный 35 миллилитров Гренье Петри блюдо. Быстро добавьте 1,5 микролитров яркого дицикла зеленого разбавленного 1000 раз в DPBS к чипу.

Зафиксировать камеру над чипом и поместить блюдо на блюдо держателя стадии сборщика клеток. Вставьте магнитную крышку и найдите перекрестие в окне живого вида. Сосредоточьтесь на перекрестье и, в окне сканирования и сортировки, выберите калибровку для автоматической инъекции и калибровки.

Замените супернатантом блюда на 1,5 миллилитров тройного E в растворе DPBS, чтобы ослабить клетки от фибронектина и открыть сканирующей вкладке. Чтобы сканировать весь чип, сосредоточьтесь на верхнем левом углу чипа в поле зрения и нажмите получить текущее положение микроскопа. Далее сосредоточьтесь на правом нижнем углу чипа и нажмите кнопку получить текущее положение микроскопа.

В всплывающем окне нажмите на самый острый плоскость и нажмите перейдите в правый верхний угол и перейдите к кнопкам нижнего левого угла. Затем нажмите закончить, чтобы начать сканирование. Когда сканирование завершено, откройте вкладку анализа и нажмите кнопку показать карту, чтобы выбрать отдельные ячейки, которые проходят критерии исследования.

Центр стекла микрокапильярии в середине микроскопа живой вид и открыть вкладку насоса. Чтобы создать вакуум, втягивайте поршень из шприца номер один 50 миллилитров и откройте вкладку сортировки. Чтобы выбрать одну ячейку, установите клапан два, который будет открыт в течение 120 миллисекунд и клапан один будет открыт в течение 20 миллисекунд после промежуток времени 200 миллисекунд.

Чтобы выбранная ячейка была успешно доставлена в ПЦР-трубку, содержащую буфер лиза, установите клапан, который будет открыт в течение 20 миллисекунд, а клапан два будет открыт в течение 10 миллисекунд после промежуток времени 10 миллисекунд. Когда настройки клапана были скорректированы, нажмите вычислить путь. Программное обеспечение будет вычислять самый быстрый путь от клетки к ячейке для сбора и введения выбранных ячеек по всему чипу.

Затем сосредоточьте микроскоп на рисунке на поверхности чипа. Используйте джойстик, чтобы переместить микрокапильярий вниз тщательно, так что резкое изображение кончика микрокапильярии могут быть получены, не касаясь поверхности чипа и нажмите набор. Откроется новое окно, показывающее микрокапильярийное сечение.

Чтобы программное обеспечение записать наконечник смещения капилляра в X, Y, и й координаты, нажмите на точный центр капилляра. Затем нажмите кнопку начать сортировку, чтобы запустить сортировку. В этом репрезентативном анализе предварительно усиленных CDNA из выбранной одной ячейки, четкая полоса в геле, как денситометрия участок был замечен соответствующий пик на 1, 852 базовых пар в электроферограмме.

Средний размер фрагментов составил 1 588 базовых пар с небольшим количеством фрагментов, которые были короче 300 базовых пар, что указывает на генерацию хорошей библиотеки cDNA. Иммунофторесцентное окрашивание и анализ также могут быть выполнены для оценки структуры саркомера в узорчатых кардиомиоцитов. Эта платформа прокладывает путь для исследования высокой пропускной способности и скрининга на наркотики различных типов сердечной недостаточности.