Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

Биологическое мелкоугольное рассеяние обеспечивает структурные измерения макромолекулы и макромолекулярных комплексов. В идеале, образец, который должен быть измерен, должен быть монодисперсным. Хотя в некоторых случаях хроматография исключения размеров SAXS не достаточна для создания монодисперсии, для создания идеализированной кривой SAXS может быть выполнена деконволюция данных SAXS на основе программного обеспечения.

Следуя этому протоколу, программа деконволюции и пользовательская программа Scatter могут быть использованы для анализа мутантов вируса Vaccinia ДНК-полимеразы exominus. Для выполнения фонового вычитания данных хроматографии исключения размера откройте программу Scatter 4 на основе Java и откройте вкладку SEC. Перетащите и уроните уменьшенные файлы данных в данные о падении ниже окна и нажмите кнопку каталога вывода и откройте для настройки каталога вывода, в котором данные будут сохранены.

Введите имя образца в сохранить в качестве окна и нажмите след. Нажмите на кнопку редактирования деталей, чтобы отредактировать экспериментальные детали и заполнить соответствующие поля. Чтобы выбрать буферные кадры вручную, нажмите набор буферов.

Левое нажатие и перетащите, чтобы переизбрание буфера в качестве плоской на кривой трассировки перед пустотным объемом столбца хроматографии исключения размера приблизительно 100 кадров и нажмите набор буфера и обновления, чтобы пересчитать файл SEC. Слева нажмите и перетащите, чтобы выбрать область интереса на сюжете сигнала и левым щелчком мыши и перетащите перекрестия в тепловой карте участка, чтобы выбрать зум и подмножество кадров, которые будут использоваться для слияния. С помощью другого левого щелчка выделите кадры на тепловой карте, соответствующие области нижнего правого поперечного волоса.

В идеале рама должна выделить область с преимущественно цианового цвета и стабильным радиусом гирации. Удовлетворив выбранные кадры, нажмите слияние, чтобы объединить вычитаемые кадры и нажмите на вкладку анализа для просмотра данных. Для деконволюции данных загрузите набор данных в программе деконволюции.

В панели управления под файлами используйте символ папки, чтобы найти данные и выделить все файлы DAT. Сюжет интегрированной интенсивности по сравнению с номером кадра будет нарисован в сюжете сериала. Под вкладкой серии нажмите, чтобы выделить кривую и открыть всплывающее окно анализа LC.

Чтобы выбрать подходящую буферную область, нажмите добавить область, чтобы выбрать область до пика хроматограммы и один после буфера переднего растворителя и нажмите набор буфера. Всплывающие окна будут указывать на то, что кадры не были выбраны для фона. Чтобы начать EFA, нажмите правой кнопкой мыши на выделенный файл и выберите EFA из меню.

В всплывающем окне следует наблюдать разложение одного значения набора данных. В поле управления проверьте значения коробки кадров использования, чтобы подтвердить, что вся область пика для деконволюта покрыта участком интенсивности. Участок значений сингулярных значений покажет интенсивность значений выше базового уровня.

Если левый и правый одиночные векторы не совпадают, измените значительное число сингулярных векторов на два и переместите кадры до тех пор, пока не будут похожи левые и правые сингулярное векторы. EFA будет рассчитываться, генерируя участки в направлениях вперед и назад для каждого вектора и указывая, когда компоненты начинают и выходят из профиля решения для выбранных данных хроматографии исключения размера SAXS. RAW попытается определить диапазоны.

При необходимости используйте стрелки для изменения диапазонов так, чтобы каждый круг был началом точки перегиба, поднимаясь с или падая на базовый уровень, и щелкните далее. Чтобы уменьшить или устранить шипы, определите, какой кадр соответствует шипу, используя стрелки управления диапазоном для регулировки элементов управления диапазоном компонентов. Когда минимальный квадрат Чи был достигнут, нажмите назад, чтобы выполнить проверку проверки.

Если исходные участки EFA по-прежнему выглядят действительными, нажмите на следующий и сохраните данные EFA для сохранения участков. Затем нажмите, чтобы закрыть окно EFA. Затем в окне RAW откройте профили в панели участка для просмотра кривых.

В вкладке профилей панели управления нажмите кнопку, чтобы сохранить кривые в качестве файлов DAT. Для определения SAXS откройте вкладку анализа рассеяния и выберите G для выбора ручного инструмента анализа Guinier. В сюжете, добавить или удалить точки так, что остатки не имеют улыбку или хмуриться функцию.

Выбранные данные в подгонки Guinier не должны превышать максимальную очередь, умноженную на радиус предела gyration 1.3. Нажмите нормализованный Kratky. Полученный участок дает оценку структурному состоянию макромолекулы, шаровой, цилиндрической, неупорядоченой, нормализованной для массы и концентрации.

Нажмите объем корреляции. Общая рассеянная интенсивность и интегрированная область общей рассеянной интенсивности в качестве функции участков q будут отображаться в качестве быстрой ссылки для проверки качества кривой рассеяния. Чтобы начать анализ гибкости, нажмите гибкость.

Каждая панель в всплывающем окне покажет участок, эксплуатируемый отношения закона власти, которая существует между компактным и удлиненными гибкими биополимами. Используйте ползунок в нижней части коробки, чтобы изменить представление данных до тех пор, пока плато в одном из участков не будет достигнуто. Сразу после проведения анализа гибкости щелкните громкость.

Всплывающее окно из трех графиков будет сгенерировано. Участок Porod-Debye отслеживает, где остался ползунок от участка гибкости, и показывает данные о районе плато. Чтобы рассчитать объем частицы, перемести точки старта и конца до тех пор, пока синяя линия на участке не будет подходит к области плато.

Для объективного результата остатки в законе о власти Пород-Дебье не должны показывать никакой закономерности. Под вкладкой P of R можно наблюдать реальное распределение пространства и кривую рассеяния для образца. В идеале кривая распределения должна быть гладкой без волн и должна просто мягко касаться х-оси.

Нажмите правой кнопкой мыши на название образца и нажмите кнопку найти DMAX, чтобы открыть новое окно. Пределы для максимального измерения заданы с предлагаемым максимальным диапазоном q, максимальными точками данных, которые будут использоваться для расчета, нижними и верхними максимальными пределами измерения, а также более низким и верхним альфа-баллом. Нажмите кнопку "Начать".

Будет создано композитное распределение вместе с предлагаемым максимальным измерением и альфа-уровнем. Если эти данные приемлемы, закройте окно, чтобы вернуться к вкладке P of R, где теперь будет обрезаться взаимный участок пространства, чтобы соответствовать предложенного максимальному диапазону. Выберите более модель и нажмите фон, чтобы установить уровень альфа и максимальное измерение предлагаемых значений из всплывающего окна.

Нажмите уточнить. Откроется участок перекрестной проверки, показывающий, должны ли какие-либо точки быть отклонены, как указано красным цветом. Если есть только несколько отклоненных точек и распределение выглядит хорошо, то модель хорошая.

Вы распечатаете отчет во вкладке анализа. Слева нажмите, чтобы выделить образец и нажмите правой кнопкой мыши на имя образца. Выберите отчет о создании из единого набора данных.

Откроется текстовый ящик для комментариев, а также будет подготовлен документ PDF с указанием всех полученных цифр и значений. В этом репрезентативном анализе, E9 ДНК полимеразы экзонуклеазы минус мутант был связан с ДНК и запустить с помощью размера исключения хроматографии малого угла рентгеновского рассеяния. Были отмечены два пика.

Первый большой пик представляет собой экзонуклеазу E9 DNA polymerase минус комплекс ДНК мутантов. А второй указывает на нескоее состояние. В то время как классический подход к выбору кадров обеспечивает стабильный радиус gyration комплекса в первом пике, второй пик явно сливается и радиус gyration по всему участку показывает, что второй пик интереса не имеет стабильного радиуса gyration из-за кросс-пик загрязнения.

В этом анализе можно было использовать только пять кадров, которые показывали полустихуляцию радиуса гирации. При вычитании, они дали радиус gyration 36.3 ангстремов. Когда пики были деконволюции с помощью EFA, соответствующая кривая для второго пика была наложена с оригиналом, показывая явное снижение сигнала к шуму и нижний радиус gyration 34.1 ангстремов.

Крацкий участок данных показывает, что комплекс с запутанным пиком более шаровой, что подтверждается кривой PR, которая дает максимальное измерение 108,5 ангстремов для деконволютной кривой. Недеконволизованные данные для этого анализа более удлиненные с максимальным измерением 120 ангстремов, скорее всего, из-за неоднородности, вытекая из несвоездной полимеразы E9 минус экзонуклеазы мутанта. Наиболее важными шагами являются выбор значений и диапазона используемых данных, поскольку они в значительной степени влияют на точность деконволюции.

Результаты не следует принимать сами по себе, а следует дополнительно оценивать с использованием дополнительных методов, таких, как аналитическая центрифугация или рассеяние многоугольного лазерного света, с тем чтобы обеспечить их биологическую интерпретацию. В строке колонки в сочетании SAXS в сочетании с деконволюцией и удобный интерфейс, как программа Scatter предоставляет мощный пакет для обеспечения значимых структурных данных даже из внутренне сложных систем.