Количественная оценка циркулирующей ДНК свиней в крови модели ксенотрансплантации

Ксенотрансплантация является возможным методом для лечения Однако, эффективный мониторинг иммунного отторжения ксенотрансплантации является проблемой для врачей и исследователей. Этот протокол является простым, удобным, недорогим и менее инвазивным методом контроля иммунного отторжения ксенотрансмутации. Этот метод может быть использован в области ксенотрансплантации, включая пересадку островка от свиньи человеку, трансплантацию почек, пересадку печени и пересадку сердца.

Начните с переноса 500 микролитров образцов крови в различные микро центрифуги труб. Добавьте в трубки 20 микролитров протеазы K и 500 микролитров буфера лиза. Затем тщательно встряхнуть их, чтобы смешать.

Положите трубки в водяной бане при 56 градусах по Цельсию в течение 10 минут, встряхивая их два-три раза во время инкубации, пока раствор не станет ясно центрифуги их кратко удалить жидкие бусы с внутренней стенки трубки охватывает. Затем добавьте 500 микролитров ангидроуса, этилового спирта и тщательно встряхните. Перенесите смесь в колонку adsorption.

Затем центрифуга колонны в течение двух минут и отказаться от отходов жидкости. Добавьте 800 микролитров раствора для полоскания в каждую колонку adorption и центрифугу в течение одной минуты. оставьте колонны при комнатной температуре на несколько минут, чтобы высушить оставшийся раствор полоскания.

Перенесите абсорбционные столбцы в чистую центробежную трубку. Добавьте 50 микролитров буфера elution к середине пленки adorption и поместите их при комнатной температуре в течение двух-пяти минут, затем центрифуга их в течение одной минуты. Подготовь мастер-микс ПЦР в соответствии с рукописными указаниями, а затем добавьте 23 микролитров смеси в каждую микро центрифугу на 0,6 миллилитров.

Добавьте два микролитров геномной ДНК в каждую трубку и тщательно Cabot. Затем кратко перемешать и центрифугу. Поместите трубки в циклер ПЦР и запустите усиление.

Когда реакция закончена выполнить агароз электрофорез. Добавьте 1,2 грамма агарозы в колбу, содержащую сто миллиметров TAE и варить его в течение пяти минут в микроволновой печи. После того, как агароза остынет примерно до 70 градусов по Цельсию, добавить пять микролитров нуклеиновой кислоты красителя в колбу, медленно, залить его в тарелку и оставить его при комнатной температуре, пока он не затвердевает в гель.

Добавьте пять микролитров каждого образца и 2-Log DNA Ladder или DNA Marker 1 в колодцы геля Агарозы и электрофореза на 120-миллионном пирсе до тех пор, пока полосы не будут разделены. Визуализуй гель с ультрафиолетовым изображением. После выполнения трансформации, описанной в рукописи текста, проинстимите плазмиды двойным ограничением переваривания ферментов с помощью EcoR I и Bam HI. Разделив переваренные продукты электрофорезом 1%Agarose и подвергайте гель ультрафиолетовому свету.

Разбавить концентрированную плазмиду фрагментом свиной ДНК в два раза от 10 до 11 копий на миллилитр для стартового стандартного раствора, используя двойную дистиллированную воду. Чтобы установить стандартную кривую, подготовь мастер-микс qPCR, как описано в текстовой рукописи, и добавьте 40 микролитров смеси в каждую трубку восьмитрубной полосы. Добавьте 10 микролитров стандартной ДНК различных концентраций, крышка труб затем кратко перемешать и центрифуги их.

Поместите трубки в машину qPCR и выполните усиление. Используйте трубки EDTA для сбора образцов крови около 400 микролитров от свиньи до обезьяны модели патч артерии, или 100 микролитров от свиньи до мыши модели трансплантации клеток. Затем перенесите образцы на 1,5 миллилитровые центрифуги.

Удалите клетки крови из образцов крови путем центрифугации при низкой температуре и высокой скорости. Перенесите супернатант в новую центрифугу 1,5 миллилитров и удалите клеточный мусор путем центрифугации в 16 000 раз G в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифугу и извлекайте циркулирующую ДНК с помощью коммерческой сыворотки, распространяя при этом набор для извлечения ДНК.

Конденсировать объем циркулирующей ДНК до 40 микролитров и хранить его при отрицательном 20 градусов по Цельсию. Выполните qPCR для количественной оценки циркулирующих свиней конкретных ДНК. Свинина конкретных грунтовки были разработаны и использованы для количественной оценки циркулирующих свиней конкретных ДНК по qPCR, в свиней к мыши модели трансплантации клеток и свиньи до обезьяны артерии патч, трансплантации моделей.

Электрофорез агароза использовался для изоляции усиленных фрагментов ДНК. С помощью ПЦР были определены праймеры, специфичные для усиленной геномной ДНК свиней. Затем были подтверждены виды этих грунтовок в когорте геномной ДНК обезьяны или человека или в когорте геномной ДНК мыши.

Наконец, два вида конкретных грунтовки, были использованы для усиления ДНК свиньи в свиней до обезьяны артерии патч и свиньи к мыши, модели трансплантации клеток. Самое главное помнить при попытке этого протокола, является то, что загрязнение всех видов должны быть предотвращены. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать новые вопросы в рамках ксенотрансплантации, потому что это простой недорогой и неинвазивный метод для мониторинга иммунного отторжения ксенотрансплантации.