Включение компенсации в режиме реального времени в быстрых фотохимических окислениях белков для определения изменений топографии белка
1 сентября 2020 г.
Быстрое фотохимическое окисление белков является новым методом структурной характеристики белков. Различные растворители добавок и лигандов имеют разнообразные гидроксиловые радикальные свойства очистки. Для сравнения структуры белка в различных условиях для нормализации реакции требуется компенсация в режиме реального времени гидроксиловых радикалов, генерируемых в реакции.
Метод облегчает измерение подтверждения белка и белковых взаимодействий. Буферный состав, чистота выборки и требования к концентрации белка являются гибкими, что позволяет методу решения сложных структурных проблем. Этот метод позволяет сдавить образцы в самых разнообразных буферных системах.
Используя наш метод дозиметрии, исследователи могут контролировать, насколько хорошо их реакции маркировки работают в режиме реального времени. Одним из применений этой технологии является разработка лекарств, поскольку она позволяет исследователям тестировать различные формулировки препарата и то, как они влияют на структуру белка. Подготовить оптическую скамейку FPOP.
Сначала включите лазер и установите лазер на внешний триггер, постоянную энергию и отсутствие замены газа. Когда лазер нагревается установить лазерную энергию на пульс от 80 до 120 миллиграммов на пульс и использовать бутан факел мягко сжигать полиимид кодирования капилляров на месте, на котором рядный дозиметр будет читать абсорбирующий сигнал на 265 нанометров после лазерного воздействия. Используйте без ворса протрите и метанол, чтобы аккуратно вытереть мусор из капилляра и поместить очищенный капилляр через лучевой путь лазера и в рядный дозиметр.
Нажмите на рычаг в верхней части inline дозиметра, чтобы открыть шарнир и удалить магнитные держатели. Поместите капилляр в машинный паз рядного дозиметра с помощью магнитных держателей, чтобы сохранить капилляр на месте и закрыть дозиметровый шарнир над капиллярным нажатием шарнира до тех пор, пока рычаг не запирается на месте. Нажмите кнопку запуска вспышки в программном обеспечении дозиметрии, чтобы начать стрельбу excimer лазера и установить заданную скорость повторения между 10 до 20 Герц в программном обеспечении дозиметрии с лазерной стрельбы двигаться моторизованной стадии через диапазон движения, гарантируя, что луч остается сосредоточенным на диафрагме и что силуэт капилляров можно наблюдать во всем.
Затем промыть капилляр с водой на 20 микролитров в минуту, по крайней мере одну минуту и нажмите стартовые данные плюс автоматический ноль в дозиметр программного обеспечения до нуля дозиметра в воду до начала сбора данных. Для выполнения эксперимента FPOP добавьте два микролитера перекиси водорода в 18 микролитров раствора FPOP и используйте пипетку, чтобы аккуратно смешать раствор, быстро соберите раствор на дне трубки центрифугой и немедленно используйте газовый жесткий шприц для загрузки раствора в шприц-насос. Нажмите стартовый насос и запустите данные в программном обеспечении дозиметра, чтобы начать поток на насосе шприца при соответствующей скорости потока и использовать стационарный дозиметр для мониторинга показаний аденина в режиме реального времени до тех пор, пока абсорбентный сигнал на 265 нанометров не стабилизирует сбор образца в контейнере для отходов.
Чтобы начать стрельбу лазером в заданной скорости повторения конце энергии нажмите кнопку запуска вспышки в программном обеспечении дозиметра и использовать стационарный дозиметр для мониторинга чтения аденина в режиме реального времени. Разница в абсорбансе на 265 нанометров с лазером и лазером на будет дельта абсорбентов на 265 нанометров чтения. Для обеспечения того, чтобы сопоставимые гидроксиловы радикалы доступны для реакции с белками в различных образцах.
Сравните дельта-абсорбенты на 265 нанометров чтения, полученные с inline дозиметра с желанием дельта абсорбентов на 265 нанометров чтения, полученные из предыдущих экспериментов или элементов управления. Если показания на нужном уровне собирают образец сразу после лазера или излучения в буфере затухления. Чтобы компенсировать эффективную радикальную дозу, чтобы уравнять показания поглощения изменить концентрацию перекиси водорода, изменить лазерную энергию на пульс или изменить фокусную плоскость фокусировки объектива, чтобы увеличить лазерную беглость.
Чтобы сделать более 10 милли абсорбянт изменения в дельта абсорбентов чтения римейк образца с более или менее перекиси водорода и повторного запуска образца, как попродемонстрировано. Чтобы внести небольшое изменение в показания абсорбирования в режиме реального времени, используйте 50-миллиметровую моторизованную ступень, чтобы отрегулировать положение фокусировки объектива, чтобы отрегулировать фокусную плоскость луча инцидента. Для измерения эффективного количества гидроксилового радикала, присутствуют в образце после лазерного излучения монитор аденин дельта абсорбентов на 265 нанометров в режиме реального времени с помощью inline УФ капиллярный детектор с помощью моторизованной стадии для регулировки положения объектива до дельты абсорбентов на 265 нанометров чтения равна желаемому чтению.
Сравнение тяжелого цепного пептидного следа биоаналога адилумумаба в фосфатном буфере и после нагрева при 55 градусах По Цельсию в течение одного часа показывает, что указанные пептидные области демонстрируют значительную защиту от растворителей при нагревании белка для формирования агрегатов. Использование рядного дозиметра в режиме реального времени для мониторинга разницы в адениных абсорбентах до и после лазера или излучения указывает на то, что сопоставимое изменение уровня адениных абсорбентов наблюдается в буфере МПС по сравнению с фосфатным буфером. В то время как среднее окисление пептидов ниже при наличии буфера МЭЗ по сравнению с фосфатным буфером.
Однако, как лазерная флюенс увеличивается, чтобы иметь равный аденин дозиметрия ответ средние значения окисления пептида почти то же самое после буфера FPOP и MES и фосфатного буфера. Как дозиметрия чтения зависит от концентрации перекиси лазерного гриппа, а также радикальные мусорщика. Позаботьтесь о том, чтобы дозиметрия ответила между выборочных опросов близко друг к другу.
Сайт направленного мутагенеза часто используется для зондирования сайтов, охраняемых в FPOP. Это позволяет исследователям определить, связаны ли изменения с Алистером. Этот метод облегчает сравнение белков в различных буферах или формулировках, что позволяет исследователям определить влияние различных добавок на подтверждение белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) — это новый метод определения характеристик белковых структур. Данный метод позволяет в режиме реального времени отслеживать генерацию гидроксильных радикалов, что дает исследователям возможность оценивать белковые взаимодействия и конформации при различных условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Характеристика белков
- Структурная биология
- Разработка лекарственных препаратов
Теоретическая часть
- В методе FPOP для окисления белков используются гидроксильные радикалы.
- Различные добавки в растворитель влияют на свойства поглощения радикалов.
- Компенсация радикалов в режиме реального времени имеет решающее значение для получения стабильных результатов.
- Метод адаптируем к различным буферным системам и условиям подготовки образцов.
Цель исследования
- Для облегчения измерения конформаций белков.
- Для исследования белковых взаимодействий в режиме реального времени.
- Для оценки влияния различных лекарственных форм на структуру белка.
Используемые методы
- Установка оптической скамьи FPOP.
- Состав гибкого буфера и требования к чистоте образца.
- Дозиметрия в реальном времени для мониторинга реакций мечения.
- Применение при тестировании лекарственных форм.
Основные результаты
- Успешное измерение белковых взаимодействий при различных условиях.
- Продемонстрированная гибкость буферных систем для решения сложных структурных задач.
- Мониторинг в режиме реального времени повысил надежность реакций мечения.
- Были отмечены потенциальные области применения в разработке лекарственных препаратов.
Выводы
- FPOP является мощным инструментом для анализа структуры белков.
- Адаптивность этого метода делает его подходящим для различных областей исследований.
- Мониторинг в режиме реального времени повышает точность экспериментальных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод быстрого фотохимического окисления белков (FPOP) позволяет в режиме реального времени компенсировать вариативность дозы гидроксильных радикалов, обеспечивая согласованность результатов окисления в гетерогенных образцах. Эта возможность способствует надежному выявлению конформационных изменений, интерфейсов связывания лигандов и белок-белковых взаимодействий на ранних этапах валидации мишеней. Предоставляя количественные измерения, основанные на доступности растворителю, FPOP повышает прогностическую точность рабочих процессов в области структурной биологии, имеющих значение для биофармацевтических исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Измерение изменений доступности растворителю для проверки терапевтических гипотез и уточнения конформационных состояний белков.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем сопоставления паттернов окисления со структурными сдвигами, специфичными для связанных лигандов или агрегатов.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов, предоставляя воспроизводимые количественные данные о «футпринте», что снижает риски, связанные с механистическими предположениями о взаимодействии с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем обеспечения стабильных и дозиметрически контролируемых результатов окисления.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет мониторинга сигнала аденина в режиме реального времени при 265 nm, что снижает вариативность, вызванную плотностью потока лазерного излучения или эффектами буфера.
- Ценность масштабируемости: Облегчение повторного использования платформы в различных буферных системах (например, фосфатном, MES) путем регулировки энергии лазера или концентрации пероксида для поддержания эквивалентной дозы радикалов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить прямое сравнение топографии белков в различных рецептурах, буферных растворах или условиях стресса (например, при тепловой агрегации).
- Принятие решений с учетом рисков: поддерживает критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем количественной оценки паттернов защиты пептидов (например, тяжелой цепи биоаналога адалимумаба) при различных условиях окружающей среды.
- Механистическое снижение рисков: позволяет отделить истинные конформационные изменения от артефактов, вызванных поглотителями радикалов или составом буфера, посредством нормализации дозы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
FPOP вписывается в континуум процесса разработки — от проверки гипотез до идентификации соединений-лидеров, особенно при оценке того, как лекарственные формы или добавки влияют на структуру белка в условиях, близких к физиологическим.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез путем картирования изменений доступности растворителю в ответ на связывание лиганда, олигомеризацию или воздействие факторов внешней среды.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые профили окисления, готовые к анализу, при условии, что дозиметрия в реальном времени стабилизирует сигнал дельта-абсорбции в разных сериях экспериментов.
- Аналитика: Предоставляет количественные измерения зависимой переменной (дельта-абсорбции на 265 nm), что позволяет сравнивать степень воздействия гидроксильных радикалов и уровень окисления между образцами.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя напрямую сравнивать топографию белка в различных буферах, что имитирует изменения в составе препаратов, встречающиеся при разработке.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как многократная платформа с дозиметрическим контролем, а не как одноразовый протокол; adaptable к различным мишеням и буферным системам путем корректировки плотности энергии лазера или концентрации пероксида.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря прямой количественной корреляции между окислением и доступностью растворителю.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет дозиметрии в режиме реального времени, которая компенсирует флуктуации лазера, распад пероксида и эффекты поглощения буфером.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать надежные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на ранних этапах поиска, что снижает риск неудач на поздних стадиях из-за неподтвержденного взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя согласованные структурные данные для гетерогенных наборов образцов, что облегчает объективное сравнение лекарственных форм или мутантов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области фотохимических систем на базе лазеров и УФ-видимой дозиметрии для точной интерпретации сигнала.
- Метод зависит от интеграции потокового УФ-капиллярного детектора и моторизованного столика для регулировки фокальной плоскости и стабилизации сигнала в режиме реального времени.
- Необходима межгрупповая стандартизация контрольных точек дозиметрии (дельта-абсорбция при 265 nm) для обеспечения сопоставимости результатов между разными центрами или экспериментами.
- При переходе между буферными системами требуются корректировки в связи с различной способностью к улавливанию радикалов (например, MES по сравнению с фосфатным буфером), что влечет за собой изменение плотности потока лазера или концентрации перекиси.
- Практическое ограничение: эффективная компенсация основана на стабильном детектировании сигнала аденина; дрейф сигнала или загрязнение капилляра могут потребовать повторной калибровки или технического обслуживания.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Fast Photochemical Oxidations of Proteins (FPOP) Optical Bench Preparation
2:43
FPOP Experiment
3:58
Compensation Performance
5:45
Results: Representative Adalimumab FPOP and Compensated Myoglobin FPOP in MES Buffer
6:51
Conclusion
