Подготовка, введение и оценка тканеспецифического клеточного поглощения in vivo липосом, меченных флуоресцентным красителем

Наш протокол сочетает в себе доступный метод получения липосом, загруженных тесаглитазаром, с тщательным подходом к оценке поглощения липосомами на клеточном уровне. Этот метод обеспечивает объективный метод оценки поглощения флуоресцентно меченных липосом, которые получены с использованием низких температур и легко приобретаемого оборудования. Чтобы получить меченые флуоресценцией липосомы, загруженные ацетатом кальция и тесаглитазаром, сначала используйте полудюймовый зонд для эмульгирования раствора эфира хлороформа липидов путем ультразвука в течение 30 секунд при комнатной температуре, 20 килогерц и 50% мощности.

Немедленно переведите гомогенизированный раствор воды и масляной эмульсии в ротационный испаритель с помощью специального адаптера, нанометрового манометра и клапана регулятора давления и подключите испаритель к вакуумной линии. Чтобы удалить органические растворители, установите скорость вращения на 100 оборотов в минуту, а вакуум на 0,5 атмосферы. После того, как гель образуется и исчезает, увеличьте вакуум до 0,9 атмосферы и отфильтруйте водную дисперсию липосомы туда и обратно через 200-нанометровый поликарбонатный фильтр в липосомном экструдере, оснащенном двумя газонепроницаемыми шприцами.

После проверки распределения по размерам с помощью динамического рассеяния света используйте двухмиллилитровую спиновую колонку, чтобы удалить любой незахваченный тесаглитазар из липосом, и используйте спектрофотометр для определения захваченной концентрации лекарства. Затем добавьте не более 500 микролитров образца липосом в сухой столбик гелевого слоя. Чтобы ввести липосомы с помощью ретроорбитальной инъекции, осторожно надавите на кожу выше и ниже открытого глаза, чтобы поднять глаз над плоскостью лица.

Затем осторожно введите кончик иглы в передний угол глаза, следя за тем, чтобы игла находилась ниже шара, не касаясь его, и медленно вводите липосомы в ретроорбитальное пространство. Чтобы получить образец крови, в соответствующей экспериментальной конечной точке осторожно сделайте надрез на коже по краю каудального конца грудной клетки мыши и разрежьте прямую линию в один сантиметр вверх по направлению к голове животного до тех пор, пока грудные мышцы не обнажаются. В месте первоначального разреза сделайте два небольших разреза перпендикулярно линии по направлению к голове и осторожно отрежьте грудную мышцу на одной стороне грудной клетки в открытой области, чтобы обеспечить лучший доступ к месту введения иглы и его визуализацию.

Вставьте иглу между третьим и четвертым ребрами так, чтобы она была как можно ближе к центральной линии грудной клетки, и осторожно потяните шприц вверх, чтобы начать сбор крови. Когда будет собрано как можно больше объема, переложите кровь в микроцентрифужную пробирку, содержащую 10 микролитров 0,5 молярной ЭДТА на льду. Чтобы извлечь паховую посттканевую подушечку с каждой стороны мыши, используйте один набор щипцов, чтобы удерживать перитонеальную мембрану с правой стороны, и второй набор щипцов, чтобы удерживать край кожи над перитонеальной мембраной с другой.

Аккуратно оттяните кожу от мембраны, чтобы отделить слои друг от друга. Прикрепите внешний край кожи, чтобы получить лучший доступ к жировому депо, и расположите паховое депо жировой ткани вдоль кожи. И найдите паховый лимфатический узел в центре жирового депо с помощью щипцов и ножниц, чтобы удалить лимфатический узел по мере необходимости.

После удаления лимфатического узла с помощью щипцов осторожно возьмитесь за конец жирового депо, ближайший к точке укола, и начните делать небольшие надрезы на соединительной мембране между жировой тканью и кожей. Приподнимите жировую ткань от кожи, делая надрезы для лучшего доступа к мембране, и поместите депо в полиэтиленовый флакон, содержащий буфер HEPES на льду. Чтобы извлечь придатковые жировые депо из каудального конца брюшинной полости, с помощью щипцов осторожно вытяните первое придатковое жировое депо из дорсального конца мыши и найдите придатки яичка и семявыносящие протоки, прикрепленные к этому депо.

Затем осторожно разрежьте между жировым депо и придатком яичка и семявыносящим протоком, чтобы отделить жировую ткань от других тканей, и поместите депо в полиэтиленовый флакон с буфером HEPES на льду. Когда все ткани будут собраны, используйте одну-две пары ножниц, чтобы измельчить образцы жировой ткани до фрагментов ткани размером 0,5 миллиметра. Затем добавьте 1,5 миллилитра буфера коллагеназы в два миллиграмма на миллилитр во флаконы с кусочками жировой ткани и поместите флаконы в встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 150 оборотах в минуту на срок от 30 до 45 минут.

Через 30 минут с помощью пипетки объемом в один миллилитр несколько раз протрите образцы. Если кусочки ткани все еще слишком велики для легкого пипетирования, верните образцы в инкубатор еще на 15 минут. После того, как образцы будут полностью переварены, измельчите фрагменты еще 10 раз, чтобы обеспечить создание одноклеточной суспензии, и процедите каждый образец через индивидуальные 70-микрометровые фильтры в одну 50-миллилитровую пробирку на образец.

Промойте каждый файл пятью миллилитрами буфера FACS, чтобы собрать оставшиеся клетки, и отфильтруйте каждую полоску в соответствующий флакон с образцом клеток на льду. Когда все образцы будут отфильтрованы, соберите клетки центрифугированием и отасканируйте надосадочную жидкость адипоцитов из образцов. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя гранулы стромально-сосудистой фракции нетронутыми, и ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре буфера FACS на пробирку.

Затем переложите суспензии в новые пробирки объемом 1,5 или 1,7 миллилитра на лед до проточного цитометрического анализа по стандартным протоколам. Динамическое рассеяние света показывает средний диаметр липосомы 163,2 нанометра и дзета-потенциал минус 19,2 милливольта. Визуализация с помощью криогенной электронной микроскопии позволяет получить круглые липосомы с относительно небольшим стандартным отклонением, полученным от среднего диаметра, измеренного с помощью динамического рассеяния света.

Проточный цитометрический анализ образцов от мышей, получавших PBS, может быть использован в качестве флуоресценции DiD минус один контроль, с помощью которого можно создать DiD-положительные затворы. Как показано в этом репрезентативном анализе, концентрация DiD в липосоме в 10 миллиграммов на миллилитр является слишком высокой, превышая количественный диапазон цитометра во всех трех протестированных тканях. Концентрация 0,1 миллиграмма на миллилитр демонстрирует некоторый сигнал, но четкой популяции за пределами клеток, обработанных PBS, не наблюдается.

Таким образом, концентрация в один миллиграмм на миллилитр, которая демонстрирует четкое отличие от контроля PBS, но при этом остается читаемой анализатором, рекомендуется для использования при подготовке липосом. Для каждого типа тканей требуются немного отличающиеся стратегии стробирования, но в каждой из них можно идентифицировать большинство одних и тех же типов клеток. После того, как конкретные популяции, представляющие интерес, идентифицированы, общий размер каждой клеточной популяции и частота, с которой они являются DiD-положительными, могут быть количественно определены.

Подготовка реагентов и оборудования, а также прогнозирование результатов на каждом этапе имеют решающее значение. Неожиданные результаты на раннем этапе могут испортить будущие результаты. Гистологические методы могут быть использованы для оценки локализации липосом во всей ткани, в то время как визуализирующая проточная цитометрия может быть использована для проверки интернализации липосом на клеточном уровне.