Дрозофила Эмбрион Подготовка и микроинъекция для live Cell Микроскопия Выполняется с помощью автоматизированного анализа высокого содержания
January 19th, 2021
Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.
Этот протокол позволяет одновременно приобретение нескольких эмбрионов в течение одного сеанса визуализации. В то время как подготовка образца адаптирована для многоточных приобретений с помощью анализатора высокого содержания, образцы, подготовленные с помощью этого протокола, могут быть изображены на любом перевернутом микроскопе, способном к многотой сделке. Для начала организуйте два ряда от 15 до 20 эмбрионов на чистом участке большой тарелки с помощью инструмента сборщика яйцеклеток.
Выравнивание эмбрионов на их брюшной стороне в той же ориентации по отношению к передним и задним концам. Придерживайтесь спейсера на крышку и полоса 10 микролитров гептана клей вниз подвергаются крышки стекла вставки. Пока клей высыхает, используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать прямоугольник вокруг двух рядов эмбрионов.
Вырежьте второй прямоугольник рядом с первым и удалите второй прямоугольник с прямой стороны края шпателя из нержавеющей стали. Аккуратно сдвиньте прямой край шпателя под первый прямоугольник и удалите его. Затем поместите вырез с эмбрионами на внешней стороне 3,5 сантиметра блюдо.
Под стерео микроскопом опустите подготовленный чехлы над эмбрионами и аккуратно прижимите два ряда эмбрионов к клею. Если не выполняет микроинъекции, заполнить силиконовый спейсер на полпути к вершине с один-к-одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27. Линия нижних краев четырехскользячой пластины адаптер с двусторонним лентой.
Это предотвратит перемещение слайда во время визуализации. Убедитесь, что не по месту ленты на пути объективного объектива. Намонтировать крышку на адаптере из четырех слайдов.
Если микроинъекции эмбрионов, поместите крышку с эмбрионами на слайд, чтобы предотвратить дно крышки от пачкаться во время высыхания и микроинъекции. Высасывайте эмбрионы в течение пяти-десяти минут, затем немедленно накройте их одним к одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27, заполняя силиконовый спейсер на полпути к вершине. Загрузите две или три микроинъекции иглы с примерно двумя микролитров инъекционных с помощью расширенной нагрузки наконечник.
Наведать иглу на микроинжектор и угнетать поршень на полпути к кончику, увеличивая давление воздуха внутри стеклянной капиллярной. Опустите стеклянную иглу на стеклянную горку и вырежьте кончик иглы новой бритвой номер девять, разрезая под углом 45 градусов для получения резкого открытого наконечника. Инжектор должен стекать вниз к нижней части кончика, не вытекая из иглы.
Аккуратно добавьте 20 микролитров галоуглеродного масла над кончиком иглы и перережьте его, открыв его под углом 45 градусов. Инъекционные должны начать течь быстро, так что не забудьте настроить давление, убирая поршень. Используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу в центре поля зрения.
Затем поднимите иглу и удалите стеклянную горку из-под нее. Поместите эмбрионы на стадии стерео микроскопа, под микроинъекционные иглы и сосредоточиться на них в 50 раз больше. Опустите иглу, пока она не попадает в ту же плоскость фокусировки, что и эмбрионы.
Перемещая слайд одной рукой и оперив микроинжектором с другой, вводите один ряд эмбрионов. Поднимите иглу и поверните слайд на 180 градусов, чтобы подвергнуть второй ряд эмбрионов микроинъекции иглы. Опустите иглу и ввись второй ряд эмбрионов.
Этот протокол был использован для изучения роли микротрубочек в эндоплазмической реорганизации ретикулум во время митоза в эмбрионе Дрозофилы. Влияние нескольких микроинъектных лекарственных препаратов на реорганизацию ER было количественно сопоставлено. Колхицин, который предотвращает новую полимеризацию микротрубочек, был найден, чтобы резко уменьшить локализацию ER шпиндель полюсов во время митоза.
Данные визуализации промежуток времени были получены для 32 эмбрионов. Измерения среднего и максимальной интенсивности были проанализированы из 12 800 областей интересов с помощью пользовательского сценария MATLAB. При попытке этого протокола в первый раз, не забудьте не занять слишком много времени на какой-либо один шаг, в противном случае вы рискуете пропустить этап развития, что вы хотите, чтобы изображение.
Практика этого протокола шаг за шагом, прежде чем пытаться каких-либо экспериментов. Наш метод подготовки образцов облегчает одновременное приобретение нескольких эмбрионов в ходе одного эксперимента, создавая тем самым достаточно экспериментальных репликаций для количественного анализа. Этот протокол может помочь развитию эмбриологии перехода от качественных к количественным экспериментам визуализации.
Возможность изображения нескольких эмбрионов в течение одного сеанса изображения также устраняет экспериментальный шум между репликациями.
Обзор
Этот протокол позволяет проводить микроинъекцию и одновременное изображение нескольких эмбрионов Drosophila во время эмбрионального развития с использованием высококачественного сканеров. Метод облегчает количественный анализ, позволяя получать изображения нескольких эмбрионов в одной сессии сканирования.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Развивающаяся биология
- Эмбриология
- Методы визуализации
Фон
- Микроинъекция является критической техникой для исследования эмбрионального развития.
- Одновременное изображение нескольких эмбрионов улучшает экспериментальные реплики.
- Количественный анализ необходим для понимания процессов развития.
- Высококачественная визуализация позволяет детально наблюдать за клеточной динамикой.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективной микроинъекции и визуализации эмбрионов Drosophila.
- Облегчить количественный анализ эмбрионального развития.
- Исследовать роль микротрубочек в реорганизации эндоплазматического ретикулума во время митоза.
Используемые методы
- Подготовка эмбрионов на предметном стекле для визуализации.
- Микроинъекция эмбрионов с определенными инъектатами.
- Временное изображение для фиксации изменений в развитии.
- Анализ измерений интенсивности с использованием скриптов MATLAB.
Основные результаты
- Лечение колхицином значительно уменьшило локализацию ЭР на полюсах веретена деления.
- Данные временного изображения были собраны для 32 эмбрионов.
- Были проведены количественные сравнения между несколькими лекарственными препаратами.
- Методология позволяет проводить надежные экспериментальные реплики.
Выводы
- Этот протокол улучшает возможности проведения количественных визуализационных экспериментов.
- Облегчает переход от качественного к количественному анализу в развивающейся биологии.
- Снижает экспериментальный шум за счет одновременного изображения нескольких эмбрионов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
High content live imaging of Drosophila embryos enables quantitative, statistically powered analysis of cellular processes in an intact organism, addressing the limitations of ex vivo and single-sample workflows. This protocol supports scalable, reproducible acquisition of multiple experimental replicates, reducing experimental noise and enhancing predictive confidence in early discovery and mechanistic studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, high-throughput in vivo imaging platforms for target validation and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cellular mechanisms in a physiologically relevant, intact system.
- Supports functional target validation by allowing manipulation and observation of multiple embryos simultaneously.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of drug or genetic perturbation effects.
- Improves predictive confidence by generating statistically significant datasets from parallel replicates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological samples for high content imaging workflows.
- Standardizes sample orientation and preparation, supporting assay reproducibility and scalability.
- Enables quantitative, multiparametric readouts suitable for compound or genetic screening.
- Reduces variability between replicates by imaging multiple embryos in a single session.
Translational & Preclinical Research
- Provides a disease-relevant in vivo model for evaluating cellular responses to perturbations.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting quantitative, organism-level imaging.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, reproducible data.
- Supports translational biomarker identification through high-content, time-lapse imaging outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, bridging the gap between cell culture and whole-organism analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of cellular events in vivo.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible samples for high-throughput imaging and quantitative analysis.
- Analytics: Provides quantitative intensity measurements and time-lapse data for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical model requirements by enabling organism-level imaging and manipulation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse mechanistic and screening applications across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes and scales sample preparation and imaging, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by generating robust, quantitative datasets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on high-content, in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and high content imaging instrumentation.
- Needs access to inverted microscopes with automated multipoint acquisition and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other model systems with similar developmental stages and imaging requirements.
- Timing and handling are critical to maintain developmental stage fidelity and data quality.
