Создание транспосонных библиотек в грам-отрицательных бактериях для секвенирования высокой пропускной способности

Этот метод имеет важное значение, поскольку он может быть использован в различных бактериальных видов для выявления основных генов, генов устойчивости к антибиотикам и генов, важных для in vivo фитнес во время инфекции. Основным преимуществом этой методики является механическое совместное использование геномной ДНК и издания Poly-CTL, которые устраняют необходимость в дорогостоящих ферментах ограничения, радиации адаптера и очистке геля. Последствия этого метода распространяются на терапию проблемных бактериальных инфекций, поскольку гены, идентифицированные как важные для инфекции или устойчивости к антибиотикам, могут служить мишенью для новых антимикробных терапевтических средств.

Этот метод может дать представление о сложных генотипов, фенотип отношений между грамотрицательных и грамположительных бактериальных видов, и улучшить наше нынешнее понимание бактериальной генетики. Для начала перенесите ночные культуры на 50 миллилитровых конических трубок, а гранулы как реципиентов, так и донорских культур с помощью центрифугации в 5000 раз G в течение 7 минут. Откажитесь от супернатанта.

Используйте 10 миллилитров серологическую пипетку, чтобы повторно приостановить гранулы донорского штамма в 4,5 миллилитров LB, дополненных диаминопимелевой кислотой. Перенесите повторно приостановленный донорский штамм в трубку штамма реципиента. И сразу же распределить брачной суспензии в качестве отдельных 100 капель микролитров на пластинах LB агар, дополняется диаминопимеловой кислотой инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем осторожно перенесите пластины на инкубатор при 37 градусах по Цельсию и позвольте культурам спариваться в течение одного часа. После инкубации добавить 1,5 миллилитров LB на каждую тарелку и собрать бактерии в 50 миллилитров конической трубки. Пеллетные матированные клетки с помощью центрифугации в 5 000 раз G в течение семи минут.

Затем отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в 10 миллилитров LB, чтобы удалить остаточную диаминопополивную кислоту Pellet клетки снова, и повторить мыть с LB. При законченном использовании 10 миллилитров серологического пипетки, чтобы повторно приостановить гранулы в 10 миллилитров LB, дополненный 25%glycerol. Распространение клеток на пластинах, в соответствии с рукописными указаниями. Затем инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию, на ночь.

Создайте один миллилитр aliquots оставшихся бактерий и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Налейте алицит замороженного спаривания на льду. Затем используйте стерильные стеклянные бусины для распространения 150 микролитров разбавления, на каждые 30 на 150 миллиметров Лурия-Бертани агар пластины, дополненной Канамицин.

Утилизировать использованную трубку, содержащую избыток спаривания, и инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 14 часов. После инкубации подсчитывайте единицы формирования колонии на каждой тарелке, чтобы оценить общее количество мутантов в транспосонной библиотеке. Подсчитайте 20% из по крайней мере 3 плит для того чтобы обусловить счет колонии для всей группы плит.

После расчета предполагаемой урожайности колонии, добавить от трех до пяти миллилитров LB к каждой пластине, и соскребать бактерии с помощью стерильного инструмента соскабливания. Вытяните бактериальные суспензии со всех пластин в 50 миллилитров конических труб, и гранулы подвески центрифугирование при 5000 раз G, в течение семи минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в пяти миллилитров LB, дополненных 30%glycerol.

Затем сделайте один миллилитр алицит из транспозорной библиотеки в криовиалах и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разбавить гДНА буфером TE до концентрации 250 нанограмм на микролитер, в общем объеме 200 микролитров, и поместить его в водяной бане sonicator. Sonicate ДНК, чтобы дать фрагменты около 300 нуклеотидов.

Подтвердите, что ДНК скошается, запуская 10 микролитров неподохващенной ДНК и 10 микролитров ДНК стрижки, на 1%hog жареный гель. Повторите звуковой, если это необходимо. Чтобы добавить хвост семян Полли к трем главным концам чистой ДНК, настройить реакцию политики, описанную в рукописи текста, и инкубировать реакционной трубки в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.

Чтобы очистить реакцию политики, добавьте 40 микролитров параметрических бусин размера к каждому образцу и вихревые реакционной трубки. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем, кратко центрифуги их собирать жидкость в нижней части трубки.

Перенесите трубки на магнитную стойку и инкубировать их при комнатной температуре в течение двух минут или до тех пор, пока раствор не будет ясен. Аккуратно снимите супернатант и добавьте 200 микролитров свежеприготовленного, 80%этанола, не нарушая бисера. Инкубировать образцы до тех пор, пока решение не будет ясным.

Затем удалите супернатант и повторите промыть этанол. Кратко центрифуга труб и положить их обратно в магнитную стойку, чтобы удалить оставшиеся жидкости. Инкубировать образцы при комнатной температуре, в течение двух-пяти минут, чтобы позволить им высохнуть.

И добавить 25 микролитров воды в каждой трубке. Vortex их в течение примерно пяти секунд или пипетки вверх и вниз. Затем центрифуга труб для сбора жидкости в нижней части.

Перенесите трубки на магнитную стойку и дайте им посидеть около двух минут, пока раствор не будет ясен. Затем перенесите супернатант в новую трубку, не нарушая бисера. Этот протокол был использован для создания высокой плотности транспосон библиотеки в A-baumannii штамм ATCC 17978, через бактериальное спряжение с использованием E-coli MFD DAP auxotroph, который повторяет плазмидный pJNW684.

Библиотека транспосонных мутантов A-baumannii использовалась для выявления фитнес-факторов, важных для устойчивости к колистину при подиннивных концентрациях антимикробных веществ. После истощения мутантной библиотеки генов, которые способствуют устойчивости Колистина, общая гДНА оставшегося библиотечного притяжения была изолирована от контроля и экспериментальных культур. ГДНК была раздроблена механическим стрижкой, и в рамках подготовки к секвенированию к фрагментам ДНК был добавлен хвост политики.

Концентрации ДНК были рассчитаны и образцы были проанализированы с использованием чипа на основе капиллярного электрофореза, чтобы подтвердить успешные сборки библиотеки. Самое главное помнить при попытке этой процедуры является корректировка объема спаривания, на основе CFU рассчитывает для конкретных целевых штаммов для создания высокого разрешения мутант библиотеки. Кроме того, штамм реципиента должен быть чувствительным к маркеру устойчивости к антибиотикам, используя транспосон до мутагенеза.

После этой процедуры, удаление генов или звук говорят метод может быть выполнен, чтобы выбить отдельные головы получить от секвенирования результатов и проверки генов, представляющих интерес в условиях оспаривается.