Полуавтоматизированная процедура ChIP-Seq для крупномасштабных эпигенетических исследований

Этот протокол важен тем, что он позволяет проводить высокопроизводительный анализ ChIP-Seq первичных образцов для лучшего понимания механизмов цис-регулирования и его влияния на заболевание. Основными преимуществами этого метода являются воспроизводимость данных и резкое сокращение времени работы в лабораторных условиях. Для сдвига хроматина добавьте 70 микролитров свежего буфера комнатной температуры для полного лизиса в фиксированную глицином, замороженную и размороженную клеточную гранулу, представляющую интерес, для одноминутной инкубации при комнатной температуре, с последующей одной минутой ресуспендирования без пузырьков.

Инкубируйте образец еще минуту при комнатной температуре, прежде чем поместить клетки на лед. Переложите ресуспендированную гранулу в 0,65 миллилитровую трубку с низким связыванием на льду, прежде чем загрузить трубку на держатель трубки ультразвукового аппарата. Заполните все зазоры балансировочными трубками, содержащими 70 микролитров воды, и дайте ячейкам стабилизироваться на водяной бане в течение примерно одной минуты перед началом ультразвуковой обработки.

После трех циклов извлеките образцы из ультразвукового аппарата для мягкого завихрения и импульсно вращайте трубки, прежде чем поместить их обратно в держатель. Для модификации гистонов добавьте 100 микролитров полного буфера tC1 в каждую пробирку из двух восьмитрубочных полосок чипа и перенесите по 20 микролитров каждого из 16 общих образцов хроматина в отдельные пробирки восьмитрубочных полосок чипа. Промойте хроматиновые пробирки 80 микролитрами полного буфера tC1 и объедините промывки в соответствующие пробирки чипа с восемью полосками для получения конечного объема 200 микролитров раствора на пробирку.

Добавьте соответствующий объем антитела к 500 микролитрам буфера TBW1, и быстро сделайте вихревой и пульсирующий спин. Затем добавьте 70 микролитров tBW1 и 30 микролитров раствора антитела в каждую пробирку нового чипа восьмитрубочной полоски. Далее тщательно перебейте емкость с раствором гранул белка А, и добавьте пять микролитров гранул на 0,5 микрограмма антитела в новую полоску пробирки.

Импульсно вращайте полоску из бусин и заполните последний ряд стружки обработчика жидкости маркированными, пустыми, стружками восьмитрубчатых полосок. Затем следуйте микросхеме 16-I Pure 200 D по программе спецификации для размещения остальных полос, и загрузите буферы в правильные позиции. После секвенирования захватите шарики в магнитную ленту с восемью трубками и перенесите 25 микролитров буфера для мечения в каждую трубку.

Сняв трубки с магнита, осторожно перемешайте, пока растворы шариков не станут однородными, прежде чем поместить повторно закрытые пробирки в предварительно нагретый термомиксер на три минуты. По окончании инкубации извлеките из чипа восьмитрубковые полоски в последний ряд чипа обработчика жидкости и добавьте по два микролитра Rnase A в каждый образец. Затем импульсно вращайте вновь укупоренные пробирки и аккуратно перемешивайте, пока растворы шариков не станут однородными.

Для очистки меченых фрагментов ДНК переложите 100 микролитров образцов сшитой ДНК D в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра и промойте пробирки 100 микролитрами буфера, связывающего ДНК, на каждую пробирку. Промывайте пробирки в соответствующих пробирках и загружайте образцы в колонки. Поместите колонки в новые пробирки для сбора объемом 1,5 миллилитра и добавьте девять микролитров буфера Tris-EDTA с температурой 55 градусов Цельсия прямо в матрицы колонок.

Через одну минуту центрифугируйте колонки и переведите девять микролитров элюата из каждой колонки в новую полоску из восьми пробирок на льду. Снова элюируйте фрагменты ДНК, как показано на рисунке, но с восемью микролитрами буфера Tris-EDTA, и объедините элюат с ранее собранным раствором фрагмента ДНК. Чтобы амплифицировать очищенные образцы фрагмента ДНК, смешайте образцы с помощью многоканальной пипетки и выполните программу амплификации с соответствующим количеством циклов.

После усиления используйте пластинчатый магнит для захвата бусин и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте шарики три раза с 200 микролитрами свежего 80% этанола на одну стирку, не нарушая гранулы гранул. После последней промывки используйте наконечник для пипетки объемом 20 микролитров, чтобы удалить излишки этанола, и дайте шарикам высохнуть в течение 10 минут или до тех пор, пока на гранулах шариков не появятся трещины.

Добавьте 40 микролитров предварительно подогретой воды в каждый высушенный образец и запечатайте пластину перед тщательным вортексированием и кратковременным импульсным вращением. Затем количественно оцените ДНК с помощью флуоресцентного количественного анализа в соответствии со стандартными протоколами. Измерения размера фрагментов хроматина с сдвигом демонстрируют высокую воспроизводимость: более 70% образцов наблюдаются от 100 до 500 пар оснований в течение 14 циклов.

Как показано на рисунке, оптимальным для определения цикла является цикл, при котором интенсивность меченого образца составляет половину среднего максимума. Наилучшие данные секвенирования получаются, когда более 85% фрагментов ДНК находятся в диапазоне от 200 до 1000 пар оснований. В этих репрезентативных треках обогащения для четырех локусов генов отдельные треки для каждого образца демонстрируют высокое качество картирования и соотношение сигнал/шум.

Первые два локуса содержат хорошо экспрессированные гены в этих типах клеток, в то время как гены в последних двух локусах не экспрессируются и служат фоновым контролем. Для большинства попарных сравнений индексы корреляции Пирсона показывают корреляцию более 90%, что предполагает высокий уровень согласованности между биологическими репликами. В то время как типоспецифичные для типа клеток локусы демонстрируют высокое обогащение соответствующими клетками, хозяйственный ген демонстрирует очень стабильную модификацию гистонов.

Корреляционный анализ между наборами данных ChIP-Seq, проведенный на выборках с менее чем 100 000 клеток, по-прежнему демонстрирует высокую воспроизводимость и корреляцию вплоть до 10 000 клеток. Однако по мере уменьшения количества клеток наблюдается повышенный фон, а также уменьшение их коэффициентов корреляции. Надлежащий лизис клеток имеет важное значение для получения высококачественных данных, поскольку мы обнаружили, что неполный лизис клеток влияет на остальную часть протокола.

Используя этот метод, можно протестировать множество различных модификаций гистонов и факторов транскрипции на различных типах клеток, представляющих интерес, чтобы углубить наше понимание цис-регуляторных элементов.