Гистологические окрашивания с использованием свободно плавающих участков тканей

Этот метод свободного плавания может быть использован для снижения иммуногистохимии на образцах тканей мозга мышей. Техника свободного плавания имеет ряд преимуществ. Получение более толстых срезов тканей, проведение крупномасштабных исследований с использованием от 30 до 40 срезов на аликвоту и долгосрочное хранение образцов.

Если вы пробуете этот метод впервые, мы рекомендуем вам попрактиковаться в монтажных секциях, которые не являются критически важными для вашего эксперимента, чтобы получить опыт работы с этим методом. Не менее чем за один-два часа до среза акклиматизируйте интересующие образцы в криостате при соответствующей температуре разреза тканей. Когда ткани готовы.

С помощью криостата можно получить срезы толщиной от 20 до 50 микрон и поместить срезы в отдельные вставки в заполненные PBS лунки шести- или 12-луночного планшета. Когда все срезы будут получены, накройте образцы примерно шестью миллилитрами на промывку в течение трех пятиминутных промывок, прежде чем переложить каждую лунку срезов в две миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие от одного до 1,5 миллилитров раствора для хранения на пробирку. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до окрашивания.

Для окрашивания срезов тканей уравновесьте образцы до комнатной температуры в течение 10–20 минут перед сцеживанием срезов во вставки в новой шестилуночной пластине. Когда весь раствор для хранения будет слит, переместите вкладыши в новые лунки, содержащие примерно шесть миллилитров TBS на лунку для трех промывок в течение пяти минут со свежим TBS на промывку на орбитальном вибростенде на низкой скорости при комнатной температуре. После последней промывки добавьте в каждую лунку по семь миллилитров свежеприготовленного блокирующего раствора для 30-минутной инкубации на шейкере при комнатной температуре.

В конце инкубации добавьте один миллилитр исследуемого первичного раствора антитела в одну двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку на каждую вставку и перенесите все срезы в каждой вставке в соответствующую двухмиллилитровую пробирку. Затем поместите трубки на вращающийся миксер. Добавьте около семи оборотов в минуту для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.

На следующее утро сцежите срезы из каждой пробирки в отдельные вставки для лунок в новой шестилуночной пластине и промойте срезы два раза по 30 секунд за промывку и один раз в течение 10 минут в свежем TBS за промывку. После последней промывки переложите группы секций в отдельные двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие один миллилитр соответствующего раствора вторичного антитела на каждую пробирку, и инкубируйте образцы в течение двух часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере с низкой скоростью, защищенной от света. В конце инкубации сцеживайте срезы по вкладышам в новую шестилуночную пластину и промойте образцы два раза в течение 30 секунд и один раз в течение 15 минут в свежем TBS за промывку, защищенном от света.

После последней промывки сцедите срезы в стеклянную прямоугольную гистологическую камеру, заполненную на три четверти TBS, и погрузите в нее предметное стекло. Используя тонкую кисть и при желании увеличительную лампу, осторожно подтяните срезы к предметному стеклу и аккуратно постучите по срезу по предметному стеклу, убедившись, что на предметном стекле нет складок или складок. Когда все секции будут запечатлены на предметном стекле, дайте предметным стеклам высохнуть в течение 10-15 минут при комнатной температуре, защищенном от света, пока секции не станут непрозрачными, и нанесите на секции соответствующую водную монтажную среду.

С помощью пинцета поместите защитное стекло на носитель и с помощью листа фильтровальной бумаги плотно надавите на защитное стекло, чтобы удалить излишки среды. Затем срезы могут быть визуализированы с помощью соответствующего микроскопа или сохранены в темной коробке с набором стекол с температурой четыре градуса Цельсия. Как видно на этих репрезентативных изображениях, флуоресцентный иммуногистохимический анализ с использованием метода свободного плавания может быть выполнен на срезах ткани мозга мыши для изучения экспрессии глиального фибриллярного кислого белка.

Этот подход также подходит для выявления белков с низкой экспрессией, таких как GFP, в образце трансгенного мозга мыши с низкой экспрессией или в протоколах нефлуоресцентного гистохимического окрашивания, таких как кресиловый фиолетовый. Другие периферические ткани также поддаются использованию этого метода без каких-либо модификаций, как это наблюдается в этих образцах ткани печени с низким уровнем GFP. Самое важное, что нужно помнить при использовании метода свободного плавания, — это бережное обращение со срезами, особенно во время переноса и когда образцы находятся на встряхивателях или ротаторах.

В дополнение к иммунофлуоресцентному окрашиванию, этот метод может быть легко модифицирован для других гистохимических красителей, таких как гематоксилин и эозин и крезил фиолетовый, или для иммуногистохимии хромогена.