Гистологические окрашивания с использованием свободно плавающих участков тканей
25 августа 2020 г.
Свободно плавающий метод позволяет исследователям выполнять гистологические окрашивания, включая иммуногистохимию на фиксированных участках ткани, для визуализации биологических структур, типа клеток, экспрессии и локализации белка. Это эффективный и надежный гистохимический метод, который может быть полезен для исследования множества тканей, таких как мозг, сердце и печень.
Этот метод свободного плавания может быть использован для снижения иммуногистохимии на образцах тканей мозга мышей. Техника свободного плавания имеет ряд преимуществ. Получение более толстых срезов тканей, проведение крупномасштабных исследований с использованием от 30 до 40 срезов на аликвоту и долгосрочное хранение образцов.
Если вы пробуете этот метод впервые, мы рекомендуем вам попрактиковаться в монтажных секциях, которые не являются критически важными для вашего эксперимента, чтобы получить опыт работы с этим методом. Не менее чем за один-два часа до среза акклиматизируйте интересующие образцы в криостате при соответствующей температуре разреза тканей. Когда ткани готовы.
С помощью криостата можно получить срезы толщиной от 20 до 50 микрон и поместить срезы в отдельные вставки в заполненные PBS лунки шести- или 12-луночного планшета. Когда все срезы будут получены, накройте образцы примерно шестью миллилитрами на промывку в течение трех пятиминутных промывок, прежде чем переложить каждую лунку срезов в две миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие от одного до 1,5 миллилитров раствора для хранения на пробирку. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до окрашивания.
Для окрашивания срезов тканей уравновесьте образцы до комнатной температуры в течение 10–20 минут перед сцеживанием срезов во вставки в новой шестилуночной пластине. Когда весь раствор для хранения будет слит, переместите вкладыши в новые лунки, содержащие примерно шесть миллилитров TBS на лунку для трех промывок в течение пяти минут со свежим TBS на промывку на орбитальном вибростенде на низкой скорости при комнатной температуре. После последней промывки добавьте в каждую лунку по семь миллилитров свежеприготовленного блокирующего раствора для 30-минутной инкубации на шейкере при комнатной температуре.
В конце инкубации добавьте один миллилитр исследуемого первичного раствора антитела в одну двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку на каждую вставку и перенесите все срезы в каждой вставке в соответствующую двухмиллилитровую пробирку. Затем поместите трубки на вращающийся миксер. Добавьте около семи оборотов в минуту для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.
На следующее утро сцежите срезы из каждой пробирки в отдельные вставки для лунок в новой шестилуночной пластине и промойте срезы два раза по 30 секунд за промывку и один раз в течение 10 минут в свежем TBS за промывку. После последней промывки переложите группы секций в отдельные двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие один миллилитр соответствующего раствора вторичного антитела на каждую пробирку, и инкубируйте образцы в течение двух часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере с низкой скоростью, защищенной от света. В конце инкубации сцеживайте срезы по вкладышам в новую шестилуночную пластину и промойте образцы два раза в течение 30 секунд и один раз в течение 15 минут в свежем TBS за промывку, защищенном от света.
После последней промывки сцедите срезы в стеклянную прямоугольную гистологическую камеру, заполненную на три четверти TBS, и погрузите в нее предметное стекло. Используя тонкую кисть и при желании увеличительную лампу, осторожно подтяните срезы к предметному стеклу и аккуратно постучите по срезу по предметному стеклу, убедившись, что на предметном стекле нет складок или складок. Когда все секции будут запечатлены на предметном стекле, дайте предметным стеклам высохнуть в течение 10-15 минут при комнатной температуре, защищенном от света, пока секции не станут непрозрачными, и нанесите на секции соответствующую водную монтажную среду.
С помощью пинцета поместите защитное стекло на носитель и с помощью листа фильтровальной бумаги плотно надавите на защитное стекло, чтобы удалить излишки среды. Затем срезы могут быть визуализированы с помощью соответствующего микроскопа или сохранены в темной коробке с набором стекол с температурой четыре градуса Цельсия. Как видно на этих репрезентативных изображениях, флуоресцентный иммуногистохимический анализ с использованием метода свободного плавания может быть выполнен на срезах ткани мозга мыши для изучения экспрессии глиального фибриллярного кислого белка.
Этот подход также подходит для выявления белков с низкой экспрессией, таких как GFP, в образце трансгенного мозга мыши с низкой экспрессией или в протоколах нефлуоресцентного гистохимического окрашивания, таких как кресиловый фиолетовый. Другие периферические ткани также поддаются использованию этого метода без каких-либо модификаций, как это наблюдается в этих образцах ткани печени с низким уровнем GFP. Самое важное, что нужно помнить при использовании метода свободного плавания, — это бережное обращение со срезами, особенно во время переноса и когда образцы находятся на встряхивателях или ротаторах.
В дополнение к иммунофлуоресцентному окрашиванию, этот метод может быть легко модифицирован для других гистохимических красителей, таких как гематоксилин и эозин и крезил фиолетовый, или для иммуногистохимии хромогена.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод свободного плавания (free-floating technique) используется для проведения иммуногистохимического анализа фиксированных срезов тканей, что позволяет визуализировать биологические структуры, типы клеток и экспрессию белков. Данный метод особенно эффективен при исследовании различных тканей, таких как мозг, сердце и печень, и обладает такими преимуществами, как возможность получения более толстых срезов ткани и применимость для крупномасштабных исследований.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Гистология
- Иммуногистохимия
- Анализ тканей
Теоретические основы
- Преимущества метода свободно плавающих срезов включают простоту манипуляций и возможность длительного хранения образцов.
- Данный метод применим к различным биологическим тканям без внесения модификаций.
- Он позволяет улучшить обнаружение белков с низким уровнем экспрессии в образцах различных типов.
Используемые методы
- Иммуногистохимическое окрашивание
- Образцы тканей мозга мыши
- Флуоресцентная микроскопия
Основные результаты
- Данный метод позволяет идентифицировать экспрессию глиального фибриллярного кислого белка.
- Он демонстрирует эффективность в условиях низкой экспрессии белка, например, в образцах трансгенных мышей с GFP.
- С помощью этой методики также могут быть применены другие методы окрашивания, такие как гематоксилин и эозин.
Выводы
- Данное исследование подчеркивает универсальность метода свободного плавания для окрашивания и анализа тканей.
- Исследователям крайне важно бережно обращаться с образцами, чтобы сохранить их целостность в ходе эксперимента.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод иммуногистохимического анализа свободно плавающих срезов позволяет эффективно обрабатывать толстые срезы тканей при проведении масштабных исследований, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в нейробиологии и исследованиях периферических тканей. Благодаря улучшению проникновения антител и возможности пакетной обработки 30–40 срезов на одну аликвоту, данный подход повышает воспроизводимость и пропускную способность рабочих процессов поиска новых мишеней. Этот метод особенно ценен для изучения паттернов экспрессии белков в сложных тканях, таких как мозг, где 3D-реконструкция нейронных проекций позволяет подтвердить достоверность мишени и определить приоритеты в портфеле разработок.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет визуализировать экспрессию и локализацию белков в толстых срезах тканей, что способствует функциональной валидации мишеней и уточнению сигнальных путей.
- Операционная ценность: облегчает обработку большого количества срезов в одной аликвоте, снижая трудозатраты при проведении крупномасштабных кампаний по скринингу биомаркеров.
- Прогностическая ценность: улучшает проникновение антител по сравнению с методами на предметных стеклах, повышая достоверность обнаружения низкоэкспрессируемых мишеней, таких как GFP в трансгенных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: совместимость с различными гистохимическими методами окрашивания, включая гематоксилин и эозин, крезиловый фиолетовый и хромогенный иммуногистохимический анализ, что обеспечивает гибкость при разработке методов исследования.
- Практическая ценность: срезы остаются в подвешенном состоянии в растворе во время окрашивания, что гарантирует равномерное воздействие реагентов и минимизирует вариативность между повторностями.
- Масштабируемость: поддержка длительного хранения при -80°C позволяет проводить серийную обработку образцов и ретроспективный анализ в рамках исследовательских проектов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Применимо как к центральной нервной системе, так и к периферическим тканям (например, печени, сердцу) без модификации протокола, что обеспечивает валидацию по различным мишеням.
- Снижение механистических рисков: Позволяет выполнять 3D-реконструкцию аксональных и дендритных проекций, обеспечивая структурный контекст для анализа взаимодействия с мишенью и изучения путей передачи сигнала.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет получать количественные данные об экспрессии белков с пространственным разрешением, которые служат основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при доклиническом выборе мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод свободного плавания вписывается в континуум поиска — от раннего тестирования гипотез относительно мишеней до идентификации перспективных соединений и доклинической валидации, в частности, в нейронауках и при оценке системной токсичности.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем анализа паттернов экспрессии белков в фиксированных тканях, что позволяет получить представление о механизмах функционирования биологической мишени.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные флуоресцентные или хромогенные результаты, подходящие для автоматизированной визуализации и платформ скрининга на основе анализа изображений.
- Аналитика: Обеспечивает получение пространственно-разрешенных данных об экспрессии, которые можно количественно оценить и сравнить в различных экспериментальных условиях для анализа модуляции мишени.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает согласованность между фундаментальными и доклиническими моделями за счет применения идентичных протоколов окрашивания для разных видов и типов тканей.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой стандартизированную адаптируемую платформу для гистологического анализа, которая может быть развернута в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает чувствительность и специфичность детекции при иммуногистохимическом анализе, сокращая количество ложноотрицательных результатов в исследованиях по валидации мишеней.
- Практическая ценность: стандартизирует процедуры обработки тканей и окрашивания, что улучшает воспроизводимость результатов между лабораториями и снижает техническую вариабельность.
- Стратегическая ценность: увеличивает пропускную способность скрининга на основе гистологии, снижая стоимость анализа одного образца и ускоряя циклы оценки рисков мишеней.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней на основе данных, предоставляя надежные многопараметрические показатели состояния тканей, которые позволяют оценить биологическую вероятность и пределы безопасности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области гистологии, изготовления срезов тканей, а также методов иммунофлуоресцентного или хромогенного детектирования.
- Необходим доступ к криостату, микротому, орбитальным шейкерам, ротационным миксерам и флуоресцентным или светлопольным микроскопам.
- Требуется использование стандартизированных блокирующих, пермеабилизирующих и промывочных буферов для минимизации неспецифического связывания и обеспечения воспроизводимости окрашивания.
- Необходима оптимизация концентраций антител и времени инкубации для каждой мишени и типа ткани, особенно для белков с низкой экспрессией.
- Требуется осторожное и бережное обращение со свободно плавающими срезами для предотвращения механических повреждений при переносе и этапах инкубации.
