Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

BMEC, полученные из iPSC, обеспечивают новые экспериментальные модели для изучения функции и дисфункции гематоэнцефалического барьера. Мы использовали этот протокол для изучения того, сохраняют ли BMEC свои барьерные свойства после расширения и криоконсервации. Этот метод позволяет создавать специфические для заболевания BMEC у пациентов с расстройствами, при которых нарушение гематоэнцефалического барьера играет роль в патофизиологии заболевания.

Чтобы индуцировать дифференцировку BMEC от человеческих ИПСК, промойте сливающуюся культуру ИПСК DPBS один раз перед инкубацией клеток с соответствующим объемом ферментативной ЭДТА в течение примерно пяти минут при 37 градусах Цельсия. Когда получена суспензия одиночных клеток, соберут клетки центрифугированием и ресуспендируют гранулу в соответствующем объеме среды стволовых клеток с добавлением 10 микромолярного ингибитора ROCK для подсчета. Разбавьте клетки до 1,56 умно-10 до четвертой клетки на кубический сантиметр концентрации и засейте два миллилитра клеток в отдельные лунки с шестилуночным плоским дном.

Через 24 часа в инкубаторе для клеточных культур замените надосадочную жидкость в каждой лунке на среду Е6 и верните планшет в инкубатор еще на четыре дня. Чтобы очистить BMEC, полученные из iPSC, покройте субкультуральные планшеты соответствующим объемом свежеприготовленного коллагена IV и раствора фибронектина на лунку и инкубируйте планшеты в течение минимум двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. На шестой день дифференцировки соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулы в соответствующем объеме свежей среды без эндотелиальной сыворотки крови человека с добавлением B27, основного фактора роста фибробластов и ретиноевой кислоты.

Для анализа TEER поместите дифференцированные клетки в каждую лунку 12-трансвелловой фильтрованной пластины, покрытой коллагеном и фибронектином. Для анализа активности транспортера оттока поместите клетки в каждую лунку 24-луночной плоской нижней пластины, покрытой коллагеном и фибронектином. После 24 часов субкультивирования замените надосадочную жидкость в каждой лунке свежей средой без эндотелиальной сыворотки человека, дополненной только добавкой B27.

Чтобы измерить свойства гематоэнцефалического барьера BMEC с помощью TEER, зарядите прибор TEER на ночь и слегка протрите электроды прибора и палочек для еды 70% этанолом, прежде чем поместить их в защитный капюшон. Включите питание и откалибруйте омметр в соответствии со спецификациями производителя. Вставьте электроды в розетку и промойте их один раз 70% этанолом и один раз DPBS.

Поместите более короткий конец электрода в нетипичную камеру вставки, а более длинный конец — в базолатеральную камеру глухого колодца. После измерения отрицательной реакции контроля быстро промойте электроды, как показано на рисунке, и измерьте первую экспериментальную лунку. После того, как все измерения будут записаны, снова промойте электроды палочками для еды, аккуратно протрите электроды и дайте им высохнуть на воздухе в защитном колпаке.

Для оценки активности клеток-транспортеров оттока на 8-й день культивирования обрабатывают соответствующее количество лунок раствором ингибитора эффлюкс-транспортера 10 микромоляров и помещают в инкубатор на один час при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации обрабатывайте клетки субстратом 10 микромолярного переносчика в течение одного часа в инкубаторе. В конце инкубации дважды промойте каждую лунку 500 микролитрами DPBS на лунку перед лизисом клеток 500 микролитрами DPBS с добавлением 5% Triton-X на лунку.

Через пять минут с помощью считывателя микропланшетов измерьте флуоресценцию лизированных клеток при возбуждении 485 нм и излучении 530 нм. Для лунок, не используемых в анализе транспортера, клетки дважды промывают DPBS перед фиксацией 4% параформальдегида на ядро клетки. После одного дня культивирования в среде Е6 морфология клеток сходна с морфологией иПСК.

К четвертому дню клетки заметно отличаются от иПСК и покрывают большую часть лунки. Двухдневное культивирование в среде, не содержащей эндотелиальной сыворотки человека, вызывает удлиненный и булыжный вид в клетках. На восьмой день отдельные клетки образуют в основном большой булыжник.

Анализ проращивания может быть выполнен для демонстрации ангиогенного потенциала BMEC, полученных из ИПССК. Это приводит к развитию трубчатых структур уже через три дня лечения фактором роста. BMEC, полученные из iPSC, полученные с использованием этого протокола, совместно экспрессировали белки плотных соединений, экспрессируемые в эндотелиальных клетках мозга, легких, печени и почек, а также маркеры эндотелия сосудов, экспрессируемые на гематоэнцефалическом барьере.

Как было замечено, через 48 часов после субкультуры и средних изменений BMEC, полученные из iPSC, демонстрируют значения TEER в диапазоне, описанном для BMEC, полученных из iPSC, которые были совместно культивированы с первичными астроцитами крыс. На этом этапе также наблюдалась активность переносчиков оттока. После криоконсервации показатели TEER ниже по сравнению со свежеполученными BMEC.

Вестерн-блоттинг показывает снижение уровня маркеров плотных соединений, таких как окклюдин, в то время как иммуноцитохимия показывает веснушчатые и/или изношенные узоры белков плотных соединений. Слишком высокая или слишком низкая плотность iPSC повлияет на эффективность дифференцировки и повлияет на развитие соответствующих свойств гематоэнцефалического барьера. Этот метод позволяет исследовать барьерные свойства, клеточную сигнализацию и активность транспортеров с использованием индивидуализированных BMEC для моделирования физиологии и патофизиологии функции гематоэнцефалического барьера.