Обнаружение генетических вариантов в гене CALR с использованием анализа плавления с высоким разрешением
26 августа 2020 г.
Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является чувствительным и быстрым решением для обнаружения генетических вариантов. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к тому, что гетеродуплексы изменяют форму кривой плавления. Путем расчесывания HRM и электрофореза агарозного геля можно идентифицировать различные типы генетических вариантов, таких как индели.
Этот метод точно определяет мутации кальретикулина у пациентов с подозрением на гематологическое заболевание, особенно в тех случаях, когда другие диагностические возможности ограничены или есть перекрытие с негематологическими состояниями. Основным преимуществом метода зеркального сканирования с высоким разрешением является обнаружение общих соматических генетических вариантов в области горячей точки гена кальретикулина на приемлемом пределе обнаружения и доступной стоимости. Этот метод позволяет быстро и неинвазивно диагностировать миелопролиферативные заболевания, особенно эссенциальную тромбоцитемию и первичный миелофиброз.
В настоящее время он не оказывает влияния на выбор терапии у этих пациентов. Однако в будущем это может измениться. Начните с подготовки мастер-смеси для количественной ПЦР HRM, как описано в текстовой рукописи, чтобы сделать достаточно для трех повторений каждого образца ДНК и контроля.
Перемешайте содержимое реакции, осторожно постукивая и переворачивая пробирку и поворачивая в течение двух-трех секунд, затем кратковременно вращайте пробирку, чтобы собрать разбросанные капли. Перелейте 19 микролитров мастер-смеси qPCR HRM в каждую лунку 96-луночного оптического реакционного планшета. Пипеткой введите один микролитр отрицательного контроля, положительного контроля и образцов в соответствующие лунки планшета для нематричного контроля или NTC в одном микролитре стерильных РНК и свободной воды ДНК, использованной для приготовления мастер-смеси HRM для количественной ПЦР вместо ДНК.
Плотно запечатайте реакционную пластину оптической клейкой пленкой, чтобы предотвратить испарение во время работы. Затем вращайте его при температуре 780 раз G при комнатной температуре в течение одной минуты. Убедитесь, что жидкость находится на дне лунок в реакционной пластине, и проведите анализ.
Назначьте элементы управления и пробы соответствующим лункам в программном обеспечении системы прибора и измените протокол усиления прибора по умолчанию. Запрограммируйте прибор так, как описано в рукописи текста, для выполнения анализа диссоциации сразу после количественной ПЦР. В конце прогона просмотрите и проверьте график усиления.
В меню эксперимента программного обеспечения системы прибора выберите опцию графика усиления. Если данные не отображаются, нажмите зеленую кнопку анализа. На вкладке График усиления в раскрывающемся меню типа графика выберите график, на котором данные усиления отображаются в виде показаний флуоресценции, нормализованных на флуоресценцию из пассивного эталона в зависимости от номера цикла, В раскрывающемся меню цвета графика выберите образец.
В раскрывающемся меню типа графика выберите тип графика линейного усиления, убедитесь, что начальный и конечный циклы базовых линий установлены правильно. Конечный цикл должен быть установлен за несколько циклов до номера цикла, в котором обнаруживается значительный флуоресцентный сигнал. В раскрывающемся меню типа графика выберите тип графика усиления log 10, покажите линию порога на графике, выбрав параметр порога, и настройте пороговое значение.
Пороговая линия должна пересекать экспоненциальную фазу на кривых количественной ПЦР. Убедитесь, что все пробные и контрольные лунки имеют нормальные кривые амплификации и что в лунках NTC нет амплификации. График нормальной амплификации показывает экспоненциальное увеличение цветения, превышающее порог между циклами 15 и 35.
В кривых производных расплава просмотрите области до и после плавления или температурные линии. Области до и после таяния должны находиться в пределах плоской области, где нет больших пиков или уклонов уровня флуоресценции. При необходимости установите пуск и остановку линий предварительной и последующей обработки температуры, расположенных на расстоянии примерно 0,5 градуса Цельсия друг от друга.
Перезапустите анализ, если параметры настроены нажатием на кнопку анализа. На вкладке «Настройки графика» вкладки «Разностный горшок» выберите одну из реплик элемента управления диким типом в качестве референсной ДНК и перезапустите анализ, нажав кнопку «Анализ». На выровненной вкладке «Кривые плавления» убедитесь, что все положительные контрольные элементы имеют правильный генотип и что NTC не удалось амплифицировать.
В таблице скважин выберите контрольную лунку, чтобы выделить соответствующую кривую расплава на графиках анализа и подтвердить, что цвет линии соответствует правильному генотипу. На вкладке «Выровненные кривые расплава» внимательно просмотрите отображение графиков для неизвестных образцов и сравните их с отображением графиков для элементов управления. Выберите лунки, содержащие реплики неизвестного образца, и выровняйте кривые плавления с элементами управления в упорядоченной последовательности, выбрав лунки, содержащие элементы управления, одну за другой.
Проанализируйте результат для неизвестной выборки на вкладке График различий, чтобы убедиться в согласованности полученных результатов. Выберите лунки, содержащие неизвестный образец и выровняйте кривые плавления с элементами управления в упорядоченной последовательности, выбирая лунки, содержащие элементы управления, одну за другой. Запустите продукты HRM для количественной ПЦР на 4%-ном агарозном сборном геле, содержащем флуоресцентный штамм нуклеиновой кислоты.
Запустите только один положительный отрицательный NTC, и образец qPCR будет реплицирован с помощью HRM. Извлеките сборный гель и кассету из упаковки, затем извлеките гребень и вставьте гель в аппарат в соответствии с инструкциями производителя. Разбавьте образец объемом 10 микролитров до 20 микролитров стерильной водой, свободной от РНК и ДНК, и загрузите в каждую лунку по 20 микролитров разведенного образца.
Разведите три микролитра стандартного размера ДНК раствора до 20 микролитров и загрузите его в маркерную лунку. Заполните все пустые лунки 20 микролитрами стерильной РНК и свободной воды ДНК. Сразу выберите программу в соответствии с процентом наносимого геля и установите время выполнения на аппарате на 20 минут.
Начните электрофорез в течение одной минуты после загрузки образцов. Когда электрофорез будет завершен, визуализируйте ДНК и гель с помощью синего света или ультрафиолетового излучения. А успешная амплификация интересующего участка ДНК с экспоненциальным увеличением флуоресцентности, превышающим порог между циклами 15 и 35, и очень узкими значениями цикла количественного определения во всех репликах и контроле является предпосылкой для надежной идентификации генетической изменчивости с помощью анализа плавления с высоким разрешением.
Анализ HRM выполняется сразу после количественной ПЦР, активные области расплава образцов, контрольные элементы и NTC используются для создания выровненных графиков кривой плавления. Правильно заданные области до и после плавления важны для правильной визуализации и выявления генетической изменчивости в образцах. Здесь показаны выровненные кривые плавления и различные горшки.
Неизвестные образцы плотно выровнены с одним из положительных контрольных показателей. Неправильно установленные области до и после плавления или температурные линии приводят к выравниванию кривых плавления и различным графикам, где правильная идентификация генетической изменчивости затруднена. Генетический вариант в образце может быть идентифицирован путем сравнения полосового рисунка образца с контрольной группой.
А также путем совмещения ЧСС и электрофореза в агарозном геле. Правильная идентификация генетического варианта может быть проведена только для образцов, которые содержат тот же генетический вариант, что и один из контрольных вариантов, используемых в анализе HRM. Образцы, содержащие редкие генетические варианты кальретикулина, различаются по результату ЧСС и рисунку полос электрофореза.
При использовании этого протокола важно тщательно сравнить выровненные графики кривой плавления известных и контрольных образцов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM) представляет собой экспресс-метод обнаружения генетических вариантов, который особенно эффективен для выявления мутаций в гене кальретикулина у пациентов с гематологическими заболеваниями. Данная методика сочетает HRM с электрофорезом в агарозном геле для дифференциации различных генетических вариантов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Детекция генетических вариантов
- Гематология
- Диагностические методы
Теоретические основы
- Мутации кальретикулина играют важную роль при миелопролиферативных заболеваниях.
- Метод HRM представляет собой неинвазивный вариант диагностики.
- Применение других диагностических методов в некоторых случаях может быть ограничено.
- Экономическая эффективность является заметным преимуществом данной методики.
Цель исследования
- Для точного определения мутаций кальретикулина.
- Для облегчения быстрой диагностики эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза.
- Для изучения потенциального влияния на выбор терапии в будущем.
Используемые методы
- Приготовление мастер-микса для qPCR HRM.
- Проведение HRM-анализа образцов ДНК.
- Использование электрофореза в агарозном геле для идентификации вариантов.
- Выполнение нескольких повторностей для обеспечения точности.
Основные результаты
- Успешная идентификация распространенных соматических генетических вариантов.
- Метод HRM продемонстрировал приемлемый предел обнаружения.
- Была достигнута быстрая и неинвазивная диагностика.
- Непосредственного влияния на выбор терапии отмечено не было.
Выводы
- HRM является ценным инструментом для выявления мутаций кальретикулина.
- Данный метод перспективен для применения в будущей диагностике.
- Дальнейшие исследования могут повлиять на стратегии лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM) позволяет осуществлять быстрый и экономически эффективный поиск соматических генетических вариантов в гене CALR, что способствует ранней диагностике миелопролиферативных новообразований в случаях, когда применение других методов ограничено. Этот подход представляет собой неинвазивный и доступный инструмент для валидации мишеней в рабочих процессах поиска в гематологической онкологии, особенно когда пациентам с отсутствием мутации JAK2 V617F требуется скрининг альтернативных биомаркеров. Благодаря сочетанию HRM с электрофорезом в агарозном геле данный метод улучшает дифференциацию вариантов в регионах, склонных к образованию инделей, что повышает достоверность прогнозов при доклинической валидации мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выявления мутаций CALR у пациентов с МПН, отрицательными по JAK2 V617F, что проясняет роль генетических драйверов, значимых для заболевания.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет быстрого генотипирования соматических вариантов в «горячей точке» CALR с использованием доступного и недорогого метода HRM на основе кПЦР.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность определения мишени за счет дифференциации аллелей дикого типа и мутантных аллелей с помощью анализа кривых плавления, что снижает количество ложноположительных результатов на ранних этапах идентификации мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем подтверждения статуса генетических вариантов в образцах, полученных от пациентов, перед тестированием соединений.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет проведения повторных контрольных запусков HRM и подтверждения с помощью агарозного геля, что повышает воспроизводимость между наборами образцов.
- Ценность масштабируемости: Облегчение повторного использования платформы в рабочих процессах генетического скрининга благодаря низкой стоимости, минимальному объему вводимого образца и совместимости со стандартными приборами для qPCR.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: обеспечивает преемственность между этапом поиска и доклиническими исследованиями путем идентификации мутаций CALR, имеющих значение для моделей эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза.
- Развитие с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет генетической стратификации подтипов MPN, что позволяет планировать доклинические исследования с учетом соответствующих биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность при валидации мишени, позволяя отличать распространенные соматические варианты от редких вариантов с помощью ортогонального HRM-анализа и подтверждения методом гель-электрофореза.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
HRM вписывается в континуум процесса разработки — от валидации мишени до идентификации ведущего соединения, что позволяет проводить раннюю генетическую стратификацию образцов пациентов перед скринингом соединений в программах гематологической онкологии.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей развития за счет выявления мутаций CALR, которые определяют молекулярные подтипы миелопролиферативных новообразований.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа с помощью количественного анализа кривых плавления и подтверждения вариантов с помощью гель-электрофореза, что гарантирует надежную оценку соединений в генетически определенных когортах.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных (сдвиги температуры плавления, форма кривых), которые позволяют сравнивать генетические варианты в образцах и контролях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем идентификации мутаций CALR с известной фенотипической значимостью в моделях MPN, поддерживая валидацию на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемым инструментом генотипирования в различных исследовательских проектах благодаря низкой стоимости, минимальным требованиям к обучению и совместимости с существующей инфраструктурой qPCR.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря точному выявлению соматических вариантов CALR.
- Практическая ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости за счет использования контролируемых протоколов qPCR HRM и подтверждения методом ортогонального гель-электрофореза.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе генетической стратификации, что сокращает инвестиции в неэффективные мишени.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации с учетом рисков путем идентификации подгрупп с мутацией CALR, имеющих более высокую вероятность взаимодействия с мишенью в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Требуются навыки настройки qPCR, анализа кривых плавления и электрофореза в агарозном геле для подтверждения вариантов.
- Зависимость от приборов с функцией анализа плавления высокого разрешения и специализированного программного обеспечения для точного выравнивания кривых и построения графиков разности.
- Необходима межлабораторная стандартизация контрольных образцов (дикого типа, мутантных, NTC) для обеспечения согласованности определения вариантов между различными центрами.
- Требуется адаптация метода при увеличении длины продукта, так как разрешение гетеродуплексов снижается, что делает необходимым электрофорез в геле для дифференциации инделей.
- Ограничено необходимостью подтверждения методом секвенирования по Сэнгеру в случаях неоднозначных результатов HRM и электрофореза, особенно для редких вариантов.
