In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет использовать существующие системы бесклеточной трансляции для анализа активной эукариотической трансляции на одной молекуле. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он сохраняет свойства объемной трансляции, обеспечивает разрешение одной молекулы и относительно прост в адаптации от других анализов объемной трансляции. Этот метод может быть применен к любой системе бесклеточного перевода, которая была проверена на возможность эффективного перевода, зависящего от конденсаторов, в условиях объемного перевода.

Демонстрировать процедуру будут Хунъюнь Ван, научный сотрудник, и Энтони Габа, старший научный сотрудник лаборатории Сяохуэй Цюй. По крайней мере, за три часа до проведения эксперимента с одной молекулой включите микроскоп-инкубатор и уменьшите поток воздуха до низкого уровня, чтобы избежать чрезмерного акустического возмущения эксперимента. Затем установите температуру инкубатора на оптимальную температуру, характерную для системы бесклеточной трансляции.

По крайней мере, за час до эксперимента нажмите кнопку питания лазера за лазерной коробкой, поверните ключ безопасности лазера и нажмите кнопку запуска, чтобы включить лазер. Включите микроскоп и выберите режим визуализации, объектив и набор фильтров. Включите камеру EMCCD, контроллер сцены, шприцевой насос и компьютер и откройте программное обеспечение камеры, лазера, моторизованного предметного столика и шприцевого насоса.

В программном обеспечении для управления лазером нажмите «Подключить», чтобы установить интенсивность лазера, снимите флажок затвора и нажмите «Управление», чтобы перетащить ползунок интенсивности во всплывающем окне управления лазером. Введите глубину проникновения, чтобы установить лазер под нужным углом, и убедитесь, что затворная коробка закрыта, чтобы лазер оставался выключенным, когда он не выполняет съемку. Когда камера остынет и стабилизируется до заданной рабочей температуры, в программном обеспечении камеры выберите кинетический режим съемки и введите параметры времени экспозиции, длины кинетического ряда и значения коэффициента усиления на электрон

Выберите директорию и назначьте имена файлов для сохранения файла образа данных. Установите шприцевой насос на умеренный или быстрый расход и добавьте 500 микролитров 70% этанола в микрофуговую пробирку. Вставьте конец трубки шприцевого насоса в раствор этанола и с помощью программного обеспечения шприцевого насоса переключите шприцевой насос между режимами забора и дозирования, чтобы промыть трубку три раза этанолом и три раза водой, не содержащей РНКазы.

После окончательной промывки водой промокните конец трубки чистой салфеткой, чтобы удалить остатки воды изнутри трубки, и поместите конец трубки в чистую микрофужерующую пробирку. Для иммобилизации трех основных видов биотинилированной мРНК поместите проточную камеру в держатель образца микроскопа стороной покровного стекла вниз и закрепите камеру лентой. Используйте ленту, чтобы закрыть входные и выходные отверстия проточного канала, которые не используются, и добавьте в проточный канал в 1,5 раза больше объема раствора стрептавидина в 200 микрограмм на миллилитр

Через 10 минут при комнатной температуре вымойте и протрите канал три раза, в три раза больше объема буфера для промывки T50 за одну промывку и сложенную лабораторную салфетку. После последней промывки капните каплю иммерсионного масла на объектив микроскопа и поместите держатель и камеру на предметный столик микроскопа. Затем поднесите объектив вплотную к покровному стеклу до тех пор, пока иммерсионное масло на объективе не коснется покровного стекла, и переместите предметный столик образца так, чтобы проточный канал находился прямо над линзой объектива.

На сенсорном экране управления микроскопом выберите вкладку фокусировки и нажмите кнопку «Поиск фокуса» и «Начать». Звуковой сигнал будет слышен при успешном достижении плоскости фокусировки. В программном обеспечении камеры выберите режим прямой трансляции.

В программном обеспечении для управления лазером откройте лазерный затвор и отрегулируйте уровень интенсивности лазера. Наблюдайте за флуоресцентным изображением в режиме реального времени в режиме реального времени и на сенсорном экране микроскопа с помощью тонкого ступенчатого регулятора для регулировки положения объектива. В программном обеспечении камеры переместите столик для оценки уровня флуоресцентного фона на различных участках поверхности обнаружения проточного канала.

Если флуоресценция низкая, остановите режим реального времени и закройте лазерный затвор в программном обеспечении управления лазером и замените буфер для промывки из проточного канала на объем, в два раза превышающий объем раствора биотинилированной мРНК. Через 15 минут промойте канал три раза, в три раза больше объема буфера, совместимого с трансляцией, за промывку. Для обнаружения одной молекулы соберите в три раза больше свежеразмороженной трансляционной смеси без мРНК и дополненной оптимизированной концентрацией флуоресцентно меченных антител в микроцентрифужной пробирке на льду и кратковременно поверните пробирку, чтобы собрать смесь на дне пробирки.

Переложите трансляционную смесь внутрь крышки микрофуг-пробирки объемом 700 микролитров и установите шприцевой насос в режим вывода. Вставьте конец трубки насоса в трансляционную смесь и начните извлечение шприца. Когда трансляционная смесь полностью войдет в трубку насоса, остановите забор, переверните настройки шприцевого насоса в режим дозирования и установите оптимальную скорость потока для подачи трансляционной смеси.

Запустите и остановите шприц, чтобы смесь для трансляции достигла конца трубки по мере необходимости, и вставьте конец трубки насоса во входное отверстие проточного канала, стараясь избежать образования пузырьков. Прикрутите изготовленный на заказ металлический кронштейн к пластине держателя образца микроскопа, чтобы стабилизировать соединение и оценить фокус микроскопа и флуоресценцию области изображения. Убедитесь в правильности параметров приобретения видеоролика и в том, что для сохранения файлов были введены соответствующие имена файлов и каталоги.

Переместите столик для получения изображения области в центре поверхности обнаружения проточного канала. И под вкладкой непрерывной автофокусировки нажмите кнопки пуска. Звуковой сигнал будет слышен, когда плоскость фокусировки будет успешно достигнута.

После уменьшения окружающего освещения откройте лазерный затвор и нажмите кнопку приема сигнала, чтобы начать запись. Через пять секунд введите команду run, чтобы доставить набор переводов в канал потока. Затем записывайте данные в течение двух часов с разрешением от 0,5 до двух секунд на кадр.

Для анализа событий связывания Cy3 ANTI-FLAG интенсивности флуоресценции выбранных пятен альфа-флага Cy3 были рассчитаны покадрово для всего фильма и соединены для формирования траектории интенсивности. Исходные траектории могут казаться зашумленными и могут потребовать уточнения с помощью нелинейного фильтра вперед/назад для уменьшения фонового шума. Дальнейшая доработка может быть достигнута с помощью алгоритмов пошагового детектирования для оцифровки траекторий.

Связывание антитела с зарождающимся полипептидом вызывает мгновенное увеличение флуоресценции, в то время как диссоциация полипептида антитела вызывает мгновенное снижение флуоресценции. Гистограмма времени задержки для мРНК люциферазного флага соответствует логарифмическому нормальному распределению и дает скорость синтеза пептидов 2,5 плюс-минус 0,1 аминокислоты в секунду. Первая гистограмма времени прихода соответствует смещенной логарифмической нормальной функции, иллюстрируя высокую степень гетерогенности в трансляции одиночной мРНК.

Как видно из гистограммы, первый синтез пептидов на отдельных молекулах мРНК люциферазного флага может начаться уже через две минуты и даже через 20 минут после доставки трансляционной смеси. По сравнению с трансляцией с помощью мРНК люциферазного флага, первая временная гистограмма с трансляцией мРНК люциферазного флага показала более медленное связывание антител. Использование объемных измерений люминесценции в бесклеточных реакциях трансляции с теми же мРНК, однако, не устраняет различия в кинетике трансляции.

Разрешение по одной молекуле в этом анализе обеспечивает более кинетическое понимание зависимой от конденсата трансляции, которое нелегко получить при использовании других подходов. Эукариотическая бесклеточная трансляция чувствительна к малым вариациям и экспериментальным условиям. Поэтому внимание к деталям и последовательность имеют решающее значение при использовании этого анализа для точного обнаружения небольших различий в переводе.