Протокол инъекций Липидико для серийных измерений кристаллографии в австралийском синхротроне

Этот протокол дает ученым возможность охарактеризовать кристаллы белка, встроенные в высоковязкие материалы, а также другие мягкие материалы, которые в настоящее время трудно охарактеризовать с помощью существующих установок. При использовании этого метода образцы подготавливаются в стеклянных шприцах, установленных непосредственно на инжекторе, что делает инжекторную систему простой в использовании и сводит к минимуму отходы проб. Чтобы получить кристаллы в среде с высокой вязкостью, сначала центрифугируйте кристаллический раствор на низкой скорости с образованием мягкой кристаллической гранулы.

После удаления лишней среды закрепите на конце одного стеклянного шприца объемом 100 микролитров соединитель и загрузите в цилиндр шприца 28 микролитров кристаллического раствора. Медленно вставьте поршень в верхнюю часть шприца и осторожно протолкните раствор до конца наконечника муфты. Чтобы удалить пузырьки, используйте один палец в перчатке, чтобы очень осторожно надавить на верхнюю часть затупленного кончика иглы муфты, чтобы создать уплотнение, и втяните поршень, чтобы оттянуть раствор от кончика иглы, чтобы создать нарастающее давление внутри шприца, затем удалите палец, чтобы быстро ослабить давление и лопнуть любые пузырьки внутри шприца.

В качестве альтернативы держите шприц в одной руке иглой вверх, а поршень зажат между двумя пальцами, и быстро поверните руку, удерживающую шприц, в одном направлении два-три раза. Полученная центробежная сила вытеснит любые пузырьки воздуха из шприца. Когда все пузырьки будут удалены, с помощью тонкого шпателя добавьте 42 микролитра высоковакуумной силиконовой смазки непосредственно в верхнюю часть второго шприца объемом 100 микролитров и нажмите на поршень до конца, чтобы удалить любые пузырьки воздуха и убедиться, что в конце шприца нет воздушной зазора.

Когда все пузырьки будут удалены из обоих шприцев, держа оба шприца за концы, прикрепите шприцы с помощью муфты. Чтобы смешать образцы, осторожно последовательно нажмите на поршни шприца с кристаллическим раствором и силиконовой смазкой от 50 до 100 раз, пока материалы полностью не перемешаются и не станут однородными. Затем визуализируйте кристаллы под оптическим микроскопом.

Чтобы определить концентрацию кристаллов в силиконовой смазке, подсчитайте количество кристаллов в определенной области с помощью изображений с помощью оптического микроскопа. Чтобы уменьшить концентрацию кристаллов, повторите подготовку кристаллов с использованием большего объема силиконовой смазки или разведите кристаллическую гранулу в кристаллизационном буфере перед установкой шприца. Чтобы увеличить концентрацию кристаллов, повторите подготовку кристаллов, используя меньший объем силиконовой смазки, стараясь не снижать вязкость ниже 10 паскальских секунд.

Когда будет получена соответствующая концентрация кристаллов, переместите весь образец в один шприц и замените соединитель инъекционной иглой внутреннего диаметра 108 микрон, очень плотно ввинченной в основание шприца. Чтобы настроить инжектор, выберите инструменты и режим самонаведения, а также отрицательный концевой выключатель, запустите самонаведение и дайте программному обеспечению работать до тех пор, пока винт не будет втянут настолько, чтобы под ним поместился шприц объемом 100 микролитров. Вставьте иглу пустого шприца через щель в держателе шприца, чтобы установить шприц на инъектор и выровнять шприц относительно кронштейна.

Оберните одно уплотнительное кольцо через среднюю часть шприца, прикрепив кольцо к крючкам с обеих сторон шприца, и оберните второе уплотнительное кольцо вокруг крючков на верхней части шприца. Убедитесь, что одна часть второго уплотнительного кольца расположена на верхней части стеклянного шприца. Чтобы подготовить шприц для образца, заправьте шприц, поместите колпачок инжектора на головку поршня шприца для образца и загрузите шприц на инжектор.

Переместите приводной винт в верхнюю часть колпачка. В программном обеспечении для управления форсункой выберите режим скорости и активируйте режим скорости. Установите значение настройки на 3 000 оборотов в минуту и нажмите Применить значение настройки.

По мере приближения винта к колпачку на головке поршня шприца, измените значение настройки на ноль. Как только контакт будет установлен, нажмите «Применить значение настройки», чтобы активировать предустановленное значение, мгновенно остановив винт. Затем аккуратно пошевелите колпачком, чтобы убедиться, что он прочно удерживается на месте.

Чтобы запустить инжектор, измените значение настройки на 100 оборотов в минуту и визуально осмотрите наконечник, чтобы наблюдать за образцом, когда он начинает выдавливаться. После закрытия домика уменьшите установочное значение на 10 декрементов, пока не будет наблюдаться медленный, но стабильный поток материала. Если поток образца течет плохо, увеличивайте значение настройки с шагом 10 оборотов в минуту, пока поток не станет более прямым.

Если поток не стабилизируется, вставьте уловитель из полистирола под поток проб, чтобы помочь направить пробу. В качестве альтернативы вставьте всасывающую воронку Вентури в улавливатель проб, которая может быть подключена к воздуховыпускной трубке, расположенной в контейнере австралийского синхротрона. Чтобы определить расход потока, воспользуйтесь калькулятором расхода прибора Lipidico.

Определение оптимальной скорости отбора проб для инжектора имеет решающее значение для стабильности потока. Низкая скорость потока приводит к расширению силиконовой смазки, выдавливаемой из инжектора, в то время как более высокая скорость потока приводит к более тонкой струе. Регулярно наблюдается закручивание потока вязких сред.

Чтобы решить эту проблему в высокозаряженных образцах, можно использовать полистирольный улавливатель для введения слабой электростатической силы. В данном анализе использовался стеклянный шприц, содержащий 26 микролитров кристаллов лизоцима, взвешенных в силиконовой смазке. В течение 38 минут было собрано достаточное количество данных, что позволило создать карту электронной плотности, окружающую дисульфидные связи в структуре лизоцима.

Не забудьте использовать небольшой объем образца на предметном стекле для оценки кристаллической концентрации образца, чтобы определить, нужно ли корректировать вязкость. Универсальность инжектора позволяет определять рентгеновские характеристики других высоковязких материалов. Например, ионные структуры жидкости с помощью исследований аккумуляторов или коллоидные материалы с помощью молочных продуктов.