Двухэтапная стратегия, которая сочетает эпигенетическую модификацию и биомеханические сигналы для создания плюрипотентных клеток млекопитающих

Протокол, показанный в этом видео, впервые сочетает в себе использование химического эпигенетического стирания с биомеханическими сигналами для индуцирования и поддержания плюрипотентности во взрослых терминально дифференцированных клетках. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он не требует трансгенных или вирусных векторов. Кроме того, он надежен, легко воспроизводим и гибок.

Этот метод не требует использования трансфекции генов и поэтому представляет собой заметный технологический прогресс в трансляционной медицине и клеточной терапии, поддерживая при этом долгосрочное культивирование клеток с высокой пластичностью. Демонстрировать процедуру будут Джорджия Пеннаросса, доцент, и Терезина Де Иорио, аспирантка из моей лаборатории. Начните с приготовления свежего одномиллимолярного стокового раствора 5-аза-CR.

Взвесьте 2,44 миллиграмма 5-аза-CR и растворите его в 10 миллилитрах DMEM с высоким содержанием глюкозы. Повторно суспендируйте порошок путем вортексирования и простерилизуйте раствор с помощью фильтра размером 0,22 микрометра. Приготовьте рабочий раствор 5-аза-ЦР, разбавив один микролитр исходного раствора в одном миллилитре питательной среды фибробластов.

Трипсинизируйте клетки, как описано в текстовой рукописи, и вытесните их с помощью осторожного пипетирования. Затем соберите клеточную суспензию и перенесите ее в коническую трубку. Подсчитывайте клетки с помощью счетной камеры под оптическим микроскопом.

Центрифугируйте клеточную суспензию при 150-кратном G в течение пяти минут. Затем удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу для получения 40 000 клеток в 30 микролитрах питательной среды фибробластов с добавлением одномикромолярного 5-аза-CR. Заполните 35-миллиметровую чашку Петри порошком ПТФЭ, чтобы получить слой, и распределите 30 микролитров клеток по порошковому слою.

Осторожно вращайте чашку Петри круговыми движениями, чтобы порошок ПТФЭ полностью покрыл поверхность капли жидкости, образуя жидкий мраморный микробиореактор. Поднимите микробиореактор для жидкого мрамора с помощью наконечника пипетки объемом 1000 микролитров, который был обрезан в соответствии с диаметром мрамора. Установите микробиореактор на чистую бактериологическую чашку Петри, чтобы стабилизировать его.

Затем перенесите микробиореактор из чашки Петри в 96-луночную пластину. Медленно добавьте 100 микролитров среды от края лунки. Микробиореактор должен плавать поверх среды.

Инкубируйте микробиореактор из жидкого мрамора в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с содержанием углекислого газа 5%. После инкубации соберите жидкий мраморный микробиореактор с помощью наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров и поместите его в новую 35-миллиметровую бактериологическую чашку Петри. С помощью иглы проколите жидкий шарик и разбейте его.

Восстановите образовавшиеся сфероиды с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, который был разрезан по краю под стереомикроскопом. Чтобы смыть остатки 5-aza-CR, перенесите органоиды в чашку Петри, содержащую среду ESC. Приготовьте новую 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую слой порошка из ПТФЭ, и нанесите на порошок один органоид в 30-микролитровой капле питательной среды ESC с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров.

Аккуратно вращайте чашку круговыми движениями, чтобы сформировать новый жидкий мраморный микробиореактор и перенесите его в лунку на 96 лунок. Добавьте 100 микролитров среды с края лунки, чтобы медленно омыть мрамор. Культивируйте жидкие мраморные микробиореакторы при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Морфологический анализ показывает, что после 18-часовой инкубации с деметилирующим агентом 5-аза-CR фибробласты трех видов млекопитающих, инкапсулированные в микробиореакторы из ПТФЭ, агрегировали и образовывали трехмерные сферические структуры с однородной геометрией размеров. В 3D-условиях 86,31% инкапсулированных клеток заметно изменили свой фенотип. Напротив, пост-5-аза-CR клетки, культивируемые в стандартных условиях 2D, были значительно меньше по размеру, с гранулированными ядрами и сохраняли монослойное распределение.

Морфологические изменения сопровождались началом экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, как в 3D, так и в 2D клетках после 5-aza-CR. Транскрипция наблюдалась для гомеобокса первого класса POU, гомеобокса NANOG, белка цинкового пальца ZFP42 и определяющей пол области Ybox2, которые отсутствуют в необработанных фибробластах. Значительное повышение регуляции молекулы адгезии эпителиальных клеток 10-11 транслокации 2 и генов кадгерина 1 также наблюдалось в 3D клетках после 5-аза-CR по сравнению с клетками, культивируемыми в стандартных 2D пластиковых чашках.

Параллельно с этим была обнаружена подавление фибробласт-специфичного маркерного антигена клеточной поверхности Thy1 как в 3D, так и в 2D клетках после 5-aza-CR. Достоверное снижение уровней метилирования как в 3D, так и в 2D клетках после 5-аза-CR было подтверждено с помощью ИФА. Уровни метилирования ДНК были значительно ниже в 3D клетках после 5-аза-CR по сравнению с клетками, культивируемыми в 2D условиях.

Кроме того, 3D-клетки после 5-аза-CR сохраняли приобретенную трехмерную сферическую структуру, высокие уровни экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, и низкие уровни метилирования ДНК в течение 28 дней, после чего культура была остановлена. Микробиореакторы также могут использоваться для поддержания оптимальных условий для прогениторных клеточных культур, а также для повышения эффективности терминальной дифференцировки.