Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии
26 сентября 2020 г.
Ультра-высокоскоростной западный метод blotting разработан путем улучшения кинетики антиген-антител связывания через циклические слива и пополнения (CDR) технологии в сочетании с иммунореакцией повышения агента.
Вестерн-блоттинг является признанным методом, который обнаруживает антигены на перенесенной мембране и обычно используется в биомедицинских исследованиях, но для завершения всей процедуры требуются часы или дни. Используя комбинацию иммуностимулирующей технологии с циклическим дренированием и пополнением, после того, как у вас есть блокадная мембрана, вся процедура может быть выполнена всего за 20 минут без ущерба для чувствительности. Поскольку вестерн-блоттинг является общим для многих различных областей исследований, он имеет широкое применение для ускорения исследований.
Успешное использование этого протокола зависит от оптимизации разведения антител реагентом, усиливающим иммунореакцию, и времени инкубации. Начните с инкубации мембран PVDF в соответствующих блокирующих буферах в течение одного часа с перемешиванием при комнатной температуре. Пока мембраны инкубируются, приготовьте 10% раствор иммунореакционного агента One или IRE1 в дистиллированной воде и хорошо обработайте его, затем разведите первичное антитело 10% IRE1, осторожно и тщательно перемешав его.
Поднимите мембрану PVDF пинцетом и кратковременно слейте раствор блокировки. Вставьте мембрану в коническую трубку с первичным антителом, следя за тем, чтобы вся мембрана прилегала к стенке трубки и чтобы сторона мембраны, которая первоначально контактировала с гелем, обращена внутрь. Плотно закупорьте трубку.
Вставьте трубку в стеклянную бутылку для гибридизационной печи и включите духовку. Инкубируйте мембрану с шестью оборотами в минуту не менее пяти минут. Остановите вращение и осторожно снимите мембрану PVDF с трубки с помощью пинцета.
Поместите мембрану в емкость с 50 миллилитрами PBST и промойте ее, затем промойте в емкости с дистиллированной водой до тех пор, пока не появятся пузырьки, которые удалят большую часть антител. Переложите мембрану в салатный блеснырь, который содержит 250 миллилитров PBST. Поместите корзину с фильтром в спиннер и убедитесь, что крышка надежно закрыта, затем активируйте спиннер и запустите его в течение 20-30 секунд.
Слейте раствор и кратко промойте внутреннюю часть спиннера дистиллированной водой. Добавьте 250 миллилитров PBST в спиннер и повторите отжим, затем инкубируйте мембрану со вторичными антителами и промойте ее снова, как описано в текстовой рукописи. Положите кусок полупрозрачной гибкой пленки на ровную поверхность.
Смешайте два компонента хемилюминесцентной подложки в пятимиллилитровой пробирке и сразу же перенесите 1,5 миллилитра смешанной подложки на полупрозрачную пленку. Поместите мембрану из ПВДФ на раствор и перенесите оставшийся раствор подложки на мембрану. Инкубируйте мембрану из ПВДФ со смешанным субстратом в течение одной минуты.
Поднимите мембрану PVDF пинцетом и коротко слейте раствор субстрата. Поместите мембрану между парой прозрачных пленок и нанесите на нее изображение в хемилюминесцентном режиме. Здесь показаны количества антигена и антитела, необходимые соответственно для хемилюминесцентного обнаружения вестерн-блоттинга.
Как в статической, так и в CDR инкубации использование растворов IRE повышало чувствительность. Аналогичным образом, минимальная концентрация антител к анти-6s His tag была снижена со 100 до 50 нанограмм на миллилитр в статических условиях и со 100 до 12,5 нанограммов на миллилитр в условиях CDR. Инкубация CDR в течение 5 или 10 минут значительно снижала предел обнаружения по сравнению со статической инкубацией.
Кроме того, комбинация CDR с IRE показала превосходную чувствительность на вестерн-блоттинге, даже в течение чрезвычайно короткого инкубационного периода. Здесь продемонстрировано успешное применение этого метода к вестерн-блоттингу с флуоресцентной детекцией. Флуоресцентное детектирование, в отличие от хемилюминесцентного детектирования, обладает уникальной способностью обнаруживать несколько мишеней на одном и том же блоттинге одновременно без удаления и повторного исследования антител.
Меченые им щелочная фосфатаза и бета-актин в клеточных лизатах были одновременно обнаружены с помощью двухцветного флуорофора. Инкубация CDR с IRE не только ускорила обнаружение, но и повысила чувствительность. Во время инкубации мембрана должна оставаться прикрепленной к стенке трубки.
Трубку следует поворачивать горизонтально так, чтобы раствор постоянно вымывался по поверхности мембраны. Этот протокол значительно ускорил продуктивность наших исследований, которая во многом зависит от западных процедур блоттинга.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика ультравысокоскоростного вестерн-блоттинга, которая значительно сокращает время проведения процедуры. Благодаря использованию технологии циклического слива и восполнения (CDR) вместе с агентом, усиливающим иммунореакцию, весь процесс может быть завершен всего за 20 минут без потери чувствительности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинские исследования
- Методы вестерн-блоттинга
- Технологии усиления иммунного сигнала
Теоретические сведения
- Вестерн-блоттинг является широко используемым методом детектирования антигенов.
- Традиционные процедуры вестерн-блоттинга могут занимать часы или даже дни.
- Повышение скорости выполнения данной методики может увеличить эффективность исследований.
- Данное исследование сосредоточено на оптимизации разведения антител и времени инкубации.
Цель исследования
- Разработать более быстрый протокол вестерн-блоттинга.
- Сохранить чувствительность метода при сокращении времени проведения процедуры.
- Продемонстрировать широкую применимость данной методики в различных областях исследований.
Используемые методы
- Использование технологии циклического слива и пополнения (CDR).
- Включение агента, усиливающего иммунореакцию (IRE1).
- Блокирование мембран PVDF в соответствующих буферах.
- Оптимизация разведения антител и времени инкубации.
Основные результаты
- Весь процесс вестерн-блоттинга может быть завершен за 20 минут.
- На протяжении всего процесса сохраняется высокая чувствительность.
- Успешная оптимизация обеспечивает эффективное детектирование антигена.
- Данный метод обладает потенциалом для широкого применения в различных областях исследований.
Выводы
- Разработанный метод значительно ускоряет процесс вестерн-блоттинга.
- Сочетание технологии CDR с иммуноусиливающими агентами является эффективным.
- Данное усовершенствование может способствовать более быстрому получению результатов исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Вестерн-блоттинг остается базовым методом валидации мишеней и анализа биомаркеров, однако длительные периоды инкубации создают узкие места в рабочих процессах высокопроизводительного поиска. Данный ультравысокоскоростной метод сокращает время анализа с нескольких часов до 20 минут при сохранении чувствительности, что позволяет проводить экспресс-анализ экспрессии белков в множестве образцов. Этот подход способствует более быстрому тестированию гипотез и идентификации перспективных соединений-лидеров за счет повышения пропускной способности анализа без ущерба для качества данных.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает возможность быстрой проверки терапевтических гипотез за счет ускоренного детектирования белков.
- Практическая ценность: Сокращает время анализа одного блота, что позволяет параллельно исследовать большее количество мишеней на ранних этапах их валидации.
- Прогностическая ценность: Сохраняет чувствительность анализа, обеспечивая надежную оценку взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных и воспроизводимых показателей экспрессии белка, пригодных для стандартизации анализа.
- Операционная ценность: совместимость как с хемилюминесцентным, так и с флуоресцентным детектированием позволяет осуществлять мультиплексный анализ и гибко выбирать способ считывания данных.
- Масштабируемость: формат с циклическим сливом и пополнением среды поддерживает адаптацию к автоматизированным или полуавтоматизированным рабочим процессам.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает согласованность анализа белков — от этапа открытия до доклинических моделей — с использованием одного и того же метода экспресс-детекции.
- Соответствие биомаркеров: позволяет оценивать посттрансляционные модификации и изоформы белков, имеющие значение для механизмов развития заболевания.
- Снижение рисков: ускоряет валидацию целевых биомаркеров, уменьшая неопределенность при принятии решений о переходе к доклиническим исследованиям.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от скрининга взаимодействия с мишенью до оптимизации лида, где экспресс-количественное определение белков служит основой для итерационных циклов проектирования.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез, обеспечивая возможность быстрого многократного измерения уровней белков при различных экспериментальных условиях.
- Скрининг: Позволяет получать стандартизированные количественные результаты, что дает возможность сравнивать связывание антител в разных образцах и условиях.
- Аналитика: Обеспечивает низкие пределы обнаружения (например, снижение требований к концентрации антител), что повышает отношение сигнал/шум при анализе низкоэкспрессируемых мишеней.
- Трансляционные исследования: Позволяет осуществлять стабильный мониторинг белков в образцах различных типов, что способствует валидации биомаркеров в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой универсальный метод, применимый в рамках множества проектов и терапевтических областей благодаря широкой совместимости.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет быстрого и воспроизводимого детектирования белков.
- Операционная ценность: Повышает пропускную способность лаборатории и эффективность использования реагентов за счет сокращения времени инкубации и расхода антител.
- Стратегическая ценность: Позволяет быстрее принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) при выборе мишеней за счет ускорения циклов получения данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя своевременные данные валидации мишеней для принятия инвестиционных решений.
Рекомендации по внедрению
- Требуется навык использования методов циклического слива и пополнения реагентов, а также опыт работы с агентами, усиливающими иммунореакцию.
- Необходимо стандартное оборудование для вестерн-блоттинга, включая печь для гибридизации, центрифугу-сушилку (salad spinner) и системы детекции для хемилюминесцентного или флуоресцентного анализа.
- При использовании агента, усиливающего иммунореакцию, требуется оптимизация разведения антител и времени инкубации.
- Необходимо обучение для обеспечения правильного обращения с мембраной на этапах слива и центрифугирования для сохранения целостности сигнала.
- Метод наиболее эффективен для лабораторий, часто проводящих вестерн-блоттинг, где экономия времени становится значительной при работе с множеством мишеней и условий.
