Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

Вестерн-блоттинг является признанным методом, который обнаруживает антигены на перенесенной мембране и обычно используется в биомедицинских исследованиях, но для завершения всей процедуры требуются часы или дни. Используя комбинацию иммуностимулирующей технологии с циклическим дренированием и пополнением, после того, как у вас есть блокадная мембрана, вся процедура может быть выполнена всего за 20 минут без ущерба для чувствительности. Поскольку вестерн-блоттинг является общим для многих различных областей исследований, он имеет широкое применение для ускорения исследований.

Успешное использование этого протокола зависит от оптимизации разведения антител реагентом, усиливающим иммунореакцию, и времени инкубации. Начните с инкубации мембран PVDF в соответствующих блокирующих буферах в течение одного часа с перемешиванием при комнатной температуре. Пока мембраны инкубируются, приготовьте 10% раствор иммунореакционного агента One или IRE1 в дистиллированной воде и хорошо обработайте его, затем разведите первичное антитело 10% IRE1, осторожно и тщательно перемешав его.

Поднимите мембрану PVDF пинцетом и кратковременно слейте раствор блокировки. Вставьте мембрану в коническую трубку с первичным антителом, следя за тем, чтобы вся мембрана прилегала к стенке трубки и чтобы сторона мембраны, которая первоначально контактировала с гелем, обращена внутрь. Плотно закупорьте трубку.

Вставьте трубку в стеклянную бутылку для гибридизационной печи и включите духовку. Инкубируйте мембрану с шестью оборотами в минуту не менее пяти минут. Остановите вращение и осторожно снимите мембрану PVDF с трубки с помощью пинцета.

Поместите мембрану в емкость с 50 миллилитрами PBST и промойте ее, затем промойте в емкости с дистиллированной водой до тех пор, пока не появятся пузырьки, которые удалят большую часть антител. Переложите мембрану в салатный блеснырь, который содержит 250 миллилитров PBST. Поместите корзину с фильтром в спиннер и убедитесь, что крышка надежно закрыта, затем активируйте спиннер и запустите его в течение 20-30 секунд.

Слейте раствор и кратко промойте внутреннюю часть спиннера дистиллированной водой. Добавьте 250 миллилитров PBST в спиннер и повторите отжим, затем инкубируйте мембрану со вторичными антителами и промойте ее снова, как описано в текстовой рукописи. Положите кусок полупрозрачной гибкой пленки на ровную поверхность.

Смешайте два компонента хемилюминесцентной подложки в пятимиллилитровой пробирке и сразу же перенесите 1,5 миллилитра смешанной подложки на полупрозрачную пленку. Поместите мембрану из ПВДФ на раствор и перенесите оставшийся раствор подложки на мембрану. Инкубируйте мембрану из ПВДФ со смешанным субстратом в течение одной минуты.

Поднимите мембрану PVDF пинцетом и коротко слейте раствор субстрата. Поместите мембрану между парой прозрачных пленок и нанесите на нее изображение в хемилюминесцентном режиме. Здесь показаны количества антигена и антитела, необходимые соответственно для хемилюминесцентного обнаружения вестерн-блоттинга.

Как в статической, так и в CDR инкубации использование растворов IRE повышало чувствительность. Аналогичным образом, минимальная концентрация антител к анти-6s His tag была снижена со 100 до 50 нанограмм на миллилитр в статических условиях и со 100 до 12,5 нанограммов на миллилитр в условиях CDR. Инкубация CDR в течение 5 или 10 минут значительно снижала предел обнаружения по сравнению со статической инкубацией.

Кроме того, комбинация CDR с IRE показала превосходную чувствительность на вестерн-блоттинге, даже в течение чрезвычайно короткого инкубационного периода. Здесь продемонстрировано успешное применение этого метода к вестерн-блоттингу с флуоресцентной детекцией. Флуоресцентное детектирование, в отличие от хемилюминесцентного детектирования, обладает уникальной способностью обнаруживать несколько мишеней на одном и том же блоттинге одновременно без удаления и повторного исследования антител.

Меченые им щелочная фосфатаза и бета-актин в клеточных лизатах были одновременно обнаружены с помощью двухцветного флуорофора. Инкубация CDR с IRE не только ускорила обнаружение, но и повысила чувствительность. Во время инкубации мембрана должна оставаться прикрепленной к стенке трубки.

Трубку следует поворачивать горизонтально так, чтобы раствор постоянно вымывался по поверхности мембраны. Этот протокол значительно ускорил продуктивность наших исследований, которая во многом зависит от западных процедур блоттинга.